維生素D在結核桿菌感染條件下對小鼠獲得性免疫表型和功能的影響及機制研究.pdf

1、背景：
　　脊柱結核是最常見的肺外結核,常導致椎體破壞和嚴重的并發(fā)癥,時刻威脅人類的健康安全。2010年,世界衛(wèi)生組織報道每年大約有146萬人死于結核。目前脊柱結核患者多數(shù)出現(xiàn)耐藥,甚至耐多種藥,使脊柱結核的化療面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。脊柱結核的化療源于結核病,深入研究結核病的發(fā)病機制,有利于脊柱結核的治療。
　　維生素D在20世紀40年代末期曾用來治療結核,20世紀50年代中期,隨著抗結核藥物的出現(xiàn),維生素D用來治療結核的熱情已明

2、顯下降。然而,現(xiàn)在越來越多的結核患者感染多耐藥菌株,出現(xiàn)結核耐藥,常規(guī)的抗結核治療無效。因此,我們反思,維生素D可能在耐藥結核中起著重要的作用,但是有關維生素D在結核病治療的療效方面還存在分歧。Morcos等報道在結核的標準化療過程中加入維生素D,明顯提高患者的臨床療效,影像學也有所改變。Nursyam等也報道結核患者治療中補充維生素D,影像學表現(xiàn)有明顯改善。最近,Martineau等發(fā)現(xiàn)口服四倍劑量的維生素D3明顯提高TaqIVDR(

3、tt基因型)結核患者痰培養(yǎng)轉換時間。相反,Wejse等認為維生素D治療未能提高結核患者的臨床治療效果,而且,Sato等闡述低水平的維生素D是活動性肺結核患者愈后良好的一個觀察指標。Koo等研究發(fā)現(xiàn),在韓國人口中,維生素D水平與結核病的發(fā)展無直接相關性,在經(jīng)過抗結核治療后,25(OH)D水平下降。因此,維生素D在結核感染中的作用機理值得進一步深入研究。
　　已有研究報道維生素D在結核感染的先天性與獲得性免疫中起著重要作用。最近,維生

4、素D如何影響結核先天性免疫已有眾多文獻明確闡明。然而,維生素D是如何影響結核獲得性免疫的研究還不夠深入。結核桿菌感染時,樹突狀細胞是啟動獲得性免疫的最基本細胞,樹突狀細胞在吞噬結核抗原后,其生物學作用發(fā)生了改變,細胞表面高表達表面共刺激分子,并逐漸移向淋巴結,這一過程是樹突狀細胞的成熟過程。而且,研究報道樹突狀細胞在吞噬Early Secretory Antigenic Target6-kDa(ESAT-6)抗原后,開始啟動CD4+T免

5、疫應答。說明樹突狀細胞在結核感染中啟動獲得性免疫應答,但維生素D在結核感染中是如何影響樹突狀細胞?相關研究還不夠深入。
　　因此,本課題的主要研究內容是:維生素D在結核桿菌感染條件下對小鼠獲得性免疫表型和功能的影響及機制。
　　方法：
　　1、建立維生素D缺乏、維生素D正常和維生素D充足三組小鼠動物模型,ELISA方法檢測三組小鼠血清中25(OH)D和1,25(OH)2D3的差異。
　　2、檢測結核桿菌感染時三組

6、小鼠脾臟CD4+T和CD8+T百分比、CD4+T/CD8+T細胞比值,同時用ELISA方法檢測脾臟細胞懸液經(jīng)TB-PPD誘導后,IFN-γ和IL-10水平。
　　3、小鼠骨髓細胞誘導成樹突狀細胞的培養(yǎng)方法及鑒定,流式檢測CD11C,MHC-II,CD80,CD86,光鏡、掃描電鏡及透射電鏡觀察細胞形態(tài)。
　　4、檢測不同維生素D水平對樹突狀細胞表達CD11C、MHC-II、CD80和CD86差異。
　　5、檢測不同濃度

7、維生素D樹突狀細胞對T細胞增殖影響。
　　6、檢測不同濃度維生素D對骨髓細胞誘導成樹突狀細胞的增殖影響。
　　7、檢測不同濃度維生素D對樹突狀細胞分泌干擾素(IFN-γ),IL-2,IL-4,IL-6,IL-10和IL-12的差異。
　　8、檢測不同濃度維生素D對樹突狀細胞表達VDR和CYP27B1的差異。
　　結果：
　　1、25(OH)D和1,25(OH)2D3在-D組、正常組和+D組分別是11.6±3

8、.56nmol/l和20±3.46pmol/l,76.5±9.13nmol/l和120±10.28pmol/l,78.1±9.16nmol/l和130±12.15pmol/l,正常組和+D組無明顯統(tǒng)計學差異。然而,25(OH)D和1,25(OH)2D3在-D組明顯少于正常組。
　　2、CD4+T在-D組、正常組、+D組百分比分別為27.1±0.6,23.62±0.42,19.46±0.32,三組之間有明顯統(tǒng)計學差異。CD8+T細胞

9、的百分比分別是12.15±0.61,8.7±0.64,7.12±0.48,三組之間有明顯統(tǒng)計學差異。CD4+T/CD8+T比值在-D組、正常組、+D組分別是2.23±0.15,2.71±0.21,2.73±0.31,三組之間有明顯統(tǒng)計學差異。細胞因子IFN-γ在-D組、正常組、+D組水平分別為416.42±16.46、325.41±11.16、276.26±25.32(單位pg/ml),三組之間有顯著統(tǒng)計學差異。細胞因子IL-10在-D

10、組、正常組、+D組分別為16.45±1.58、24.31±2.16、26.28±0.42(單位pg/ml),三組之間有統(tǒng)計學差異。
　　3、小鼠骨髓細胞成功誘導成樹突狀細胞。CD11C的陽性率平均為87.23％,MHC-II的陽性率平均為89.26%,CD86的陽性率平均為58.94%,CD80的陽性率平均為84.69%。光鏡、掃描電鏡和透射電鏡結果示典型枝狀突起。
　　4、CD11C在對照組、25(OH)D3(100nM)

11、組、1,25(OH)2D3(10pM)組及1,25(OH)2D3(100nM)組分別是84.64%±4.00,82.28%±7.27(p=0.85),81.17%±6.15(p=0.79)和32.25%±3.02(P<0.001),共刺激分子的表達在對照組、25(OH)D3(100nM)組、1,25(OH)2D3(10pM)組及1,25(OH)2D3(100nM)組分別是:MHC-II:88.75%±4.14,85.92%±4.05(p

12、=0.54),83.37%±3.96(p=0.46)和46.65%±1.24(P<0.001);CD80:84.51%±8.63,84.75%±9.37(p=0.68),83.15%±8.48(p=0.61)and65.67±7.12(P<0.001);CD86:57.08%±9.55,51.32%±9.21(P<0.05),50.15%±8.76(P<0.05)and15.69%±3.12(P<0.001)。
　　5、25(OH

13、)D3(100nM)組和1,25(OH)2D3(10pM)組降低了T淋巴細胞的增殖,1,25(OH)2D3(100nM)組明顯降低了T淋巴細胞的增殖。
　　6、OD值在對照組、25(OH)D3(100nM)組、1,25(OH)2D3(10pM)組及1,25(OH)2D3(100nM)組分別是0.61±0.25,0.54±0.25,0.49±0.24和0.21±0.15。對照組明顯促進樹突狀細胞的增殖,維生素D組抑制了樹突狀細胞的增

14、殖。
　　7、同對照組相比,在25(OH)D3(100nM)組、1,25(OH)2D3(10pM)組,IFN-γ、IL-2、IL-6和IL-10明顯升高,IL-4降低。然而,IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10和IL-12在1,25(OH)2D3(100nM)明顯降低,IL-4明顯升高。
　　8、小鼠骨髓細胞誘導的樹突狀細胞能表達CYP27B1和VDR,在25(OH)D3(100nM)組,CYP27B1的表達高于對照組

15、,但在1,25(OH)2D3(100nM)和對照組無差別。VDR的表達,在25(OH)D3(100nM)組比對照組低,但在1,25(OH)2D3(100nM)和對照組無差異。
　　結論：
　　1、通過控制食物和光照,成功建立維生素D缺乏小鼠動物模型。維生素D缺乏明顯影響小鼠抗結核免疫功能,提示維生素D缺乏與結核易感密切相關。
　　2、結核桿菌感染時,維生素D通過調節(jié)樹突狀細胞VDR和CYP27B1的表達來影響它的成熟和