孕期母體鎘暴露與胎兒生長受限的關(guān)聯(lián)及其機(jī)制研究.pdf

1、孕期母體鎘暴露與胎兒生長受限（fetal growth restriction，F(xiàn)GR）的關(guān)聯(lián)尚存在爭議。本課題擬用實(shí)驗(yàn)室前期建立的中國安徽出生隊列研究（China-Anhui Birth Cohort Study，C-ABCS）平臺，以合肥出生隊列3352對單胎母嬰為樣本人群，分析孕期不同階段鎘暴露分別與低出生體重（low birth weight，LBW）和小于胎齡兒（small for gestational age，SGA）的關(guān)

2、聯(lián)強(qiáng)度；在成功建立鎘誘導(dǎo)胎鼠生長受限的孕鼠模型基礎(chǔ)上，觀察鎘在母體、胎盤和胎體內(nèi)的分布和代謝情況以及對胎盤結(jié)構(gòu)與功能的損害效應(yīng)；探討孕期鎘暴露對小鼠胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用，并進(jìn)一步研究鎘對人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用；研究自由基清除劑 N-叔丁基-α-苯基硝酮（N-tert-butyl-α-phenylnitrone，PBN）對鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的拮抗效應(yīng)，以闡明活性氧在鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用；探討IRE1小干擾RNA（

3、small interfering RNAs，siRNAs）轉(zhuǎn)染對鎘下調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)泵表達(dá)的拮抗效應(yīng)，以闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme1，IRE1）信號通路在鎘損害人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能中的作用。本研究為最終闡明孕期母體鎘暴露引起胎兒生長受限的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　第一部分：孕期鎘暴露與胎兒生長受限（FGR）關(guān)聯(lián)的人群研究
　　目的：探討孕期不同階段鎘暴露分

4、別與低出生體重（LBW）和小于胎齡兒（SGA）的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。
　　方法：本研究從C-ABCS中選擇合肥出生隊列，抽取該隊列已經(jīng)收集的3352例孕婦和新生兒出生資料、孕婦血清標(biāo)本，用石墨爐原子吸收分光光度法檢測孕婦血清鎘含量。
　　結(jié)果：鎘檢測結(jié)果顯示，該隊列孕婦平均血清鎘含量為0.89μg/L。按照孕婦血清鎘含量≥P75分為高鎘組，而血清鎘含量＜P75低鎘組，分析孕期不同階段母體高鎘暴露引起LBW和SGA發(fā)生的RR及其95％C

5、I。整個孕期3352例孕婦資料分析結(jié)果表明，孕期高鎘暴露組新生兒LBW發(fā)生率為4.3%（RR為2.25；95%CI：1.45，3.49；P<0.001），在控制孕期BMI、孕婦年齡、月平均收入和孕婦血清采集時間等變量后，高鎘暴露誘導(dǎo)新生兒發(fā)生LBW的RR為2.21（95%CI：1.43，3.42；P<0.001）；孕期高鎘暴露組SGA發(fā)生率為10.5%（RR為1.43；95%CI：1.09，1.86；P=0.009），調(diào)整RR為1.41

6、（95%CI：1.08，1.85；P=0.011）。孕早期1122例孕婦資料分析結(jié)果顯示，孕早期高鎘暴露組新生兒LBW發(fā)生率為2.5%（RR為1.26；95%CI：0.52，3.08；P=0.608），在控制孕期BMI、孕婦年齡和月平均收入等變量后，高鎘暴露誘導(dǎo)新生兒發(fā)生LBW的RR為1.26（95%CI：0.52，3.08；P=0.606）；孕早期高鎘暴露組SGA發(fā)生率為9.4%（RR為1.20；95%CI：0.75，1.93；P=0

7、.446），調(diào)整RR為1.18（95%CI：0.73，1.90；P=0.498）。孕中晚期2230例孕婦資料分析結(jié)果顯示，孕中晚期高鎘暴露組新生兒LBW發(fā)生率為5.2%（RR為2.70；95%CI：1.63，4.49；P<0.001），在控制孕期 BMI、孕婦年齡和月平均收入等變量后，高鎘暴露誘導(dǎo)新生兒發(fā)生LBW的RR為2.79（95%CI：1.68，4.66；P<0.001）；孕中晚期高鎘暴露組SGA發(fā)生率為11.1%（RR為1.55

8、；95%CI：1.12，2.13；P=0.008），調(diào)整RR為1.54（95%CI：1.11，2.12；P=0.009）。
　　結(jié)論：孕中晚期母體高鎘暴露顯著升高LBW和SGA發(fā)生風(fēng)險。
　　第二部分：孕期鎘暴露損害胎鼠發(fā)育和胎盤結(jié)構(gòu)與功能的動物實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探討孕期鎘暴露對胎鼠發(fā)育和胎盤結(jié)構(gòu)與功能的損害作用。
　　方法：本研究由3個實(shí)驗(yàn)組成。實(shí)驗(yàn)1，本研究采用兩種方法建立胎兒生長受限的孕鼠模型，一種方法是

9、受孕第9天（gestational day9，GD9）小鼠經(jīng)腹腔單次給予氯化鎘（4.5 mg/kg）溶液，另一種方法是受孕第13天至17天（GD13-17）小鼠每日上午經(jīng)腹腔注射單次給予氯化鎘（0.5 mg/kg）溶液。兩種方法均于GD18早晨剖殺孕鼠，然后測量胎鼠身長和重量。實(shí)驗(yàn)2，為了探討孕期母體鎘暴露對母體、胎盤和胎體鎘分布的近期和遠(yuǎn)期影響，受孕第9天小鼠被腹腔單次給予氯化鎘（4.5 mg/kg），GD10和GD18分別剖殺孕鼠，

10、收集母鼠（血清、肝臟和腎臟）、胎盤和胎鼠相關(guān)標(biāo)本，用石墨爐原子吸收分光光度法檢測樣品鎘含量。實(shí)驗(yàn)3，為了探討孕期母體鎘暴露對小鼠胎盤結(jié)構(gòu)與功能的影響，受孕第9天小鼠被單次腹腔注射NS或氯化鎘（4.5 mg/kg），于GD10和GD18分別收集小鼠胎盤。GD18小鼠胎盤被稱重和測量胎盤直徑，GD10和GD18部分胎盤固定后做組織病理學(xué)檢查，部分胎盤提取RNA行定量PCR檢測。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)1結(jié)果顯示，孕中期單次鎘暴露或孕晚期多次鎘

11、暴露均明顯降低胎鼠身長和體重，而母鼠無明顯中毒體征。這提示，孕期母體鎘暴露誘導(dǎo)胎鼠生長受限。實(shí)驗(yàn)2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GD9小鼠被鎘處理后，GD10母鼠血清、肝臟和腎臟鎘含量分別升高2.8、80.5和13.4倍，GD10胎盤和胚胎分別升高60.2和11.5倍；GD18母鼠血清、肝臟和腎臟鎘含量分別升高2.2、300.9和34.3倍，GD18胎盤和胚胎分別升高47.4和4.9倍，而GD18胎鼠血清鎘含量無變化。這些研究結(jié)果充分提示，進(jìn)入母體的鎘在胎

12、盤組織蓄積，僅有少量鎘透過胎盤屏障進(jìn)入胎鼠體內(nèi)。實(shí)驗(yàn)3結(jié)果表明，孕期鎘暴露明顯減輕小鼠胎盤重量和降低胎盤直徑。HE染色結(jié)果顯示，孕期母體鎘暴露明顯減少胎盤迷路層平均血竇區(qū)面積；TUNEL染色和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）免疫染色結(jié)果表明，孕期母體鎘暴露明顯促進(jìn)胎盤細(xì)胞凋亡和抑制胎盤細(xì)胞增殖。定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕期母體鎘暴露明顯下調(diào)小鼠胎盤營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)泵（Glut

13、1、Znt1、Zip1和Pcft）、生長因子及其受體（Pgf、Igf2、Vegfr1和Igf2r）mRNA表達(dá)。這些結(jié)果提示，孕期母體鎘暴露明顯引起小鼠胎盤結(jié)構(gòu)與功能障礙。
　　結(jié)論：孕期母體鎘暴露引起胎盤鎘蓄積，導(dǎo)致胎盤結(jié)構(gòu)與功能障礙，并誘發(fā)胎鼠生長受限。
　　第三部分：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IRE1信號在鎘損害胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能中的作用及其機(jī)制研究
　　目的：探討活性氧在鎘誘發(fā)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IRE1信號在鎘損害胎盤功

14、能中的作用。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)由3個實(shí)驗(yàn)組成。實(shí)驗(yàn)1，為了探討鎘對小鼠胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)的影響，受孕第9天小鼠被單次氯化鎘（4.5 mg/kg），于鎘處理后0、2、8和24 h收集小鼠胎盤，分別檢測不同時點(diǎn)小鼠胎盤組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)2，為了探討活性氧在鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的調(diào)控作用，受孕第9天小鼠在氯化鎘（4.5 mg/kg，i.p.）處理前0.5 h和處理后4 h給予PBN

15、（100 mg/kg，i.p.），于鎘處理后8和24 h收集小鼠胎盤，檢測胎盤氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)3，為了探討未折疊蛋白反應(yīng)下游IRE-1α信號通路在鎘下調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)泵和生長因子表達(dá)中的作用，人JEG-3細(xì)胞在鎘處理前轉(zhuǎn)染IRE-1siRNAs，于鎘處理后12 h收獲細(xì)胞，用定量RT-PCR技術(shù)檢測營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)泵和生長因子mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)1結(jié)果顯示，孕期母體鎘暴露明顯上調(diào)小鼠胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

16、和未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)基因（Grp78和Atf4）mRNA及相關(guān)蛋白（GRP78，peIF2α和CHOP）表達(dá)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，不同濃度的鎘顯著上調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)蛋白（pIRE1α、peIF2α、CHOP、pJNK和GRP78）表達(dá)，但存在時間效應(yīng)，鎘暴露2 h后胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而12 h和24 h后GRP78蛋白表達(dá)卻顯著下調(diào)；鎘暴露6 h后胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞pIRE1α蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而

17、24 h的pIRE1α蛋白水平卻低于0 h；隨著時間增加，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞peIF2α、CHOP和pJNK蛋白表達(dá)均逐漸升高。上述結(jié)果提示，鎘顯著誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)2結(jié)果表明，自由基清除劑PBN顯著對抗鎘上調(diào)胎盤組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白（GRP78、peIF2α和CHOP）表達(dá)，緩解鎘對小鼠胎盤還原型谷胱甘肽（GSH）的耗竭，且拮抗鎘上調(diào)胎盤組織3-硝基酪氨酸（3-NT）和血紅素氧化酶1（HO-1）蛋白表達(dá)。這些

18、研究結(jié)果提示，活性氧至少部分介導(dǎo)鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。實(shí)驗(yàn)3結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鎘處理明顯下調(diào)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)泵（GLUT1、FATP4、PCFT）和生長因子（PGF和IGF2）mRNA表達(dá)，IRE-1 siRNA預(yù)處理明顯對抗鎘下調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞生長因子（PGF和IGF2）mRNA表達(dá)，而對鎘下調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)泵（GLUT1、FATP4、PCFT）mRNA表達(dá)無影響。上述結(jié)果提示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)下游IRE-1信號部分介導(dǎo)

19、鎘損害胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)分泌功能。
　　結(jié)論：鎘暴露顯著誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)，活性氧在鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中起關(guān)鍵作用，而未折疊蛋白反應(yīng)下游IRE1通路在鎘損害胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)分泌功能中起重要作用。
　　綜合以上三部分研究結(jié)果，本文得出如下結(jié)論：（1）孕期母體鎘暴露顯著升高胎兒生長受限的發(fā)生風(fēng)險；（2）孕期母體鎘暴露引起胎盤鎘蓄積，導(dǎo)致胎盤結(jié)構(gòu)與功能障礙，并誘發(fā)胎鼠生長受限；（3）鎘顯著誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)