幽門螺桿菌和甲型流感病毒特異性CD4+T細胞免疫優(yōu)勢應答研究.pdf

1、研究背景
　　目前,由致病微生物引起的感染性疾病仍然屬于危害人類生命的主要殺手。宿主抗感染免疫應答是決定感染性疾病發(fā)展和轉歸的關鍵因素。獲得性免疫應答是宿主抵抗致病微生物再次感染的關鍵,也是疫苗發(fā)揮作用的基礎。CD4+T細胞應答在獲得性免疫應答中發(fā)揮中樞作用:首先,其能促進B細胞分化成熟并產生抗體,輔助抗體類型的轉換;其次,能促進CD8+T細胞的增殖并輔助記憶CD8+T細胞的形成;還能分泌多種細胞因子直接干擾病毒的復制,或通過招募

2、其他免疫細胞到達感染部位間接對病原體進行清除,甚至可以像CD8+T細胞那樣介導對病毒感染靶細胞的直接殺傷。
　　CD4+T細胞應答具有抗原特異性、HLA限制性和免疫優(yōu)勢應答等特性。CD4+T細胞應答的抗原特異性是指其只能識別由13-20個氨基酸組成的表位,而不是整個抗原或整個病原體,使得同一病原體或蛋白抗原誘導的CD4+ T細胞應答在表位水平具有不同的特異性。CD4+T細胞應答的HLA限制性是指:不同HLA分子通過遞呈不同的表位而

3、誘導產生不同的表位特異性CD4+T細胞應答,使得不同個體之間因HLA分子的差異產生不同表位特異性應答。免疫優(yōu)勢應答即,在針對復雜病原體時,由于HLA的共顯性特征,同一個體中的不同 HLA分子能同時遞呈多個抗原表位誘導產生不同表位特異性應答,各應答之間相互抑制,產生強弱差異,使得主要的應答僅僅聚焦于少數表位,形成優(yōu)勢應答。優(yōu)勢應答能發(fā)揮更強的抗感染免疫作用,但病原體可通過突變優(yōu)勢應答表位逃避殺傷。因此,研究CD4+T細胞抗原特異性、HLA

4、限制性以及免疫優(yōu)勢應答特征對揭示機體的抗感染免疫機制,研發(fā)有效疫苗等具有重要意義。
　　幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H. pylori)是定植于人胃粘膜的重要致病菌,是胃炎、胃潰瘍等胃部疾病的主要致病因素,與胃癌、粘膜相關淋巴瘤的發(fā)生密切相關,目前我國每年因胃癌死亡人數高達20萬人。甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)是一種能夠導致人類及動物罹患流行性感冒的RNA病毒,其每年會造成全球

5、約50萬人的死亡,且常在世界范圍內周期性大流行。研究證實,CD4+T細胞應答在宿主抵抗H. pylori和IAV感染的保護性免疫應答中至關重要。但其抗原特異性、HLA限制性及免疫優(yōu)勢應答特征研究甚少,有待深入系統(tǒng)的研究。
　　研究目的
　　1.利用H. pylori與IAV自然感染人體外周血中的記憶細胞,建立H. pylori與IAV抗原特異性CD4+ T細胞系,觀察其效應分子表達情況,探討其在抗H. pylori與IAV感

6、染免疫中的可能作用;
　　2.篩選鑒定H. pylori與IAV抗原特異性CD4+T細胞的優(yōu)勢應答抗原及表位,比對表位序列保守性,評價其在H. pylori與IAV疫苗設計中的可能應用;
　　3.明確H. pylori與IAV不同表位特異性優(yōu)勢CD4+ T細胞應答的HLA限制性,發(fā)掘H. pylori與IAV抗原特異性CD4+T細胞應答在含有相同或者不同HLA基因型個體中的優(yōu)勢應答特征及規(guī)律;
　　4.分析H. pyl

7、ori感染不同個體的優(yōu)勢應答頻率及其與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等疾病發(fā)生發(fā)展的相關性,揭示優(yōu)勢應答對H. pylori感染導致不同類型胃病發(fā)生與轉歸的作用和機制;
　　研究方法
　　1. H. pylori粘附素A亞單位(H. pylori adhesion A subunit,HpaA)抗原特異性CD4+T細胞免疫優(yōu)勢應答特性研究
　　利用13C呼氣試驗、血清抗H. pylori抗體ELISA法及尿素酶試紙法篩選H

8、. pylori感染者;利用重組HpaA蛋白體外刺激H. pylori感染者PBMC擴增建立HpaA特異性CD4+T細胞系;通過ICS技術對HpaA特異性CD4+T細胞效應分子表達譜進行檢測;利用步移重疊合成肽對優(yōu)勢抗原表位進行篩選鑒定;利用PCR-SBT法對HLA進行基因分型;利用抗體阻斷和 BLCL表位遞呈實驗對表位HLA限制性進行鑒定;通過體外誘導單核細胞來源的樹突狀細胞及BLCL對表位的自然加工遞呈特征進行鑒定;通過MACS技術

9、及ELISPOT技術對優(yōu)勢表位特異性CD4+T細胞的記憶表型及離體頻率進行檢測;通過比較多個HLA-DRB1*1501陽性個體的優(yōu)勢應答譜系對優(yōu)勢應答規(guī)律進行分析;通過分析H. pylori感染所致慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等疾病個體之間優(yōu)勢CD4+ T細胞應答頻率的差異,揭示優(yōu)勢應答對H. pylori感染導致不同類型胃病發(fā)生與轉歸的作用和機制。
　　2. IAV抗原特異性CD4+T細胞免疫優(yōu)勢應答特性研究
　　利用IAV

10、感染P815細胞裂解物全抗原體外刺激擴增建立IAV特異性CD4+T細胞系;通過重組痘病毒感染P815細胞裂解物制作的IAV單個抗原對免疫優(yōu)勢蛋白抗原進行篩選;利用步移重疊合成肽對優(yōu)勢抗原表位進行鑒定;利用PCR-SBT基因分型、抗體阻斷和BLCL表位遞呈實驗對表位HLA限制性進行鑒定;利用ICS技術對IAV表位特異性CD4+ T細胞效應分子表達譜進行檢測;利用多序列比對對表位序列保守性進行評價。
　　主要結果
　　1. Hp

11、aA抗原特異性CD4+T細胞免疫優(yōu)勢應答特性研究
　　1.1成功創(chuàng)立HpaA特異性CD4+T細胞系培養(yǎng)方法。該方法能從H. pylori感染陽性者PBMC特異性擴增出HpaA特異性CD4+T細胞系,而H. pylori感染陰性者PBMC不能擴增出HpaA特異性CD4+T細胞系。
　　1.2研究發(fā)現(xiàn)HpaA特異性CD4+ T細胞系主要分泌IFN-γ,不分泌IL-4、IL-10和IL-17A,屬于Th1型CD4+T細胞應答。

12、r>　　1.3首次篩選鑒定出HpaA192-204,HpaA88-100和HpaA200-212三個H. pylori抗原的功能性免疫優(yōu)勢CD4+T細胞表位。
　　1.4研究確定了HpaA192-204、HpaA88-100和HpaA200-212三個免疫優(yōu)勢表位特異性CD4+T細胞應答的HLA限制性分別是DRB1*0406、DRB1*1501和DQB1*0301。
　　1.5研究證實了上述優(yōu)勢表位特異性CD4+T細胞具有記

13、憶表型,且體外擴增過程不會改變免疫優(yōu)勢應答譜系。
　　1.6研究證實了上述優(yōu)勢表位均能夠被抗原遞呈細胞自然加工遞呈,且部分表位氨基酸序列在H. pylori不同菌株之間高度保守,可作為H. pylori表位疫苗的候選抗原。
　　1.7從1115例胃部疾病患者篩選出59例HLA-DRB1*1501陽性的H. pylori感染患者,研究發(fā)現(xiàn)HpaA88-100特異性CD4+T細胞應答在攜帶HLA-DRB1*1501基因的H. p

14、ylori感染陽性個體中處于免疫優(yōu)勢地位。
　　1.8首次證實HLA-DRB1*1501介導的HpaA88-100特異性CD4+T細胞應答頻率與H. pylori感染所致慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等胃部疾病的嚴重程度呈負相關關系,提示HLA-DRB1*1501對胃部疾病的保護作用是通過介導優(yōu)勢CD4+ T細胞應答來實現(xiàn)的,也表明HpaA88-100為H. pylori特異的保護性表位。
　　2. IAV抗原特異性CD4+T細

15、胞免疫優(yōu)勢應答特性研究
　　2.1成功制備出可溶性IAV感染P815細胞全抗原,并以此成功創(chuàng)立IAV全抗原特異性CD4+T細胞系培養(yǎng)方法。
　　2.2研究發(fā)現(xiàn)IAV全抗原特異性CD4+T細胞系主要分泌分泌IFN-γ和TNF-α,不分泌IL-2,但上調表達CD107分子。表明IAV抗原特異性CD4+T細胞主要通過IFN-γ和TNF-α直接干擾病毒復制和直接的細胞毒性作用介導抗病毒保護性免疫。
　　2.3成功制備出可溶性I

16、AV單個抗原,研究證實了M1與NP是IAV特異性CD4+T細胞應答的優(yōu)勢抗原靶標。
　　2.4篩選鑒定出M1129-141、M1209-221、NP404-416和NP463-475等四個免疫優(yōu)勢IAV特異性CD4+T細胞表位以及M143-55、M194-106、M1103-115、M1105-117、NP102-114和NP115-127等六個亞優(yōu)勢IAV特異性CD4+T細胞表位。
　　2.5研究明確了M1129-141、

17、M1209-221、NP404-416和NP463-475四個免疫優(yōu)勢 IAV特異性 CD4+ T細胞應答的 HLA限制性分別是 DRB1*0101、DPB1*0301、DRB1*0404和DRB1*0901;M143-55、M194-106、M1103-115、M1105-117、NP102-114和 NP115-127等六個亞優(yōu)勢 IAV特異性 CD4+ T細胞應答的 HLA限制性分別是DRB1*0701、DRB1*1302、DRB

18、1*0404、DRB1*0901、DPB1*0101和DPB1*0601。
　　2.6研究發(fā)現(xiàn)在新流行的IAV菌株中存在著大量表位突變體,且免疫優(yōu)勢表位的突變頻率大于亞優(yōu)勢表位,表明優(yōu)勢表位比亞優(yōu)勢表位面臨著更大的選擇壓力。
　　研究意義
　　1.本課題創(chuàng)立了利用H. pylori自然感染個體PBMC體外擴增培養(yǎng)建立HpaA抗原特異性CD4+T細胞系的方法。篩選鑒定了H. pylori第一個HLA限制的并具有免疫原性的

19、CD4+T細胞表位。首次對H. pylori保護性抗原HpaA特異性CD4+T細胞應答的免疫優(yōu)勢特性進行了系統(tǒng)性分析。并證實HLA-DRB1*1501介導的HpaA88-100特異性優(yōu)勢CD4+ T細胞應答對H. pylori所致慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌等疾病具有保護性作用。為H. pylori保護性抗原免疫優(yōu)勢表位的篩選鑒定提供了新的方法,為深入理解抗原特異性CD4+T細胞應答在H. pylori感染免疫中的優(yōu)勢應答特性及其對H.

20、pylori感染導致不同類型胃病發(fā)生與轉歸的作用和機制提供新的認識,也為 H. pylori新型疫苗設計提供了新的候選抗原。
　　2.本課題利用IAV感染P815細胞制作的可溶性IAV全抗原創(chuàng)立了IAV多克隆抗原特異性CD4+T細胞系的培養(yǎng)方法。首次從IAV全基因組蛋白水平明確了IAV抗原特異性CD4+T細胞應答所聚焦的優(yōu)勢抗原靶標是M1與NP。篩選鑒定了若干M1與NP來源的新的免疫優(yōu)勢及亞優(yōu)勢CD4+T細胞表位。系統(tǒng)分析比較了優(yōu)