特異性提高小麥胚乳中β-胡蘿卜素含量的研究.pdf

1、類(lèi)胡蘿卜素的含量是小麥營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要組成部分。雖然不同小麥品種中的類(lèi)胡蘿卜素含量有很大差異，但主要積累的都是不能轉(zhuǎn)化成維生素A的葉黃素和玉米黃質(zhì)，且含量都比較低。隨著對(duì)類(lèi)胡蘿卜素生物學(xué)功能研究的不斷深入，類(lèi)胡蘿卜素越來(lái)越受到重視，研究人員希望開(kāi)發(fā)出快速有效的手段來(lái)提高植物中的類(lèi)胡蘿卜素含量，特別是主糧作物中的類(lèi)胡蘿卜素含量。由于目前對(duì)高等植物中類(lèi)胡蘿卜素合成代謝調(diào)控的機(jī)制仍知之甚少，它限制了精準(zhǔn)的類(lèi)胡蘿卜素代謝工程的應(yīng)用進(jìn)程。因此，為深

2、入研究類(lèi)胡蘿卜素合成代謝的調(diào)控機(jī)制，首先需要克隆和鑒定更多的類(lèi)胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵合成酶基因，為更加精準(zhǔn)的類(lèi)胡蘿卜素代謝工程提供理論支持。有鑒于此，本論文主要從以下兩個(gè)方面開(kāi)展研究工作：小麥番茄紅素環(huán)化酶基因(Lycopeneβ-cyclase,TaLCYB)的克隆及功能鑒定；過(guò)表達(dá)歐文氏菌八氫番茄紅素合成酶基因CrtB結(jié)合干擾胡蘿卜素羥基化酶基因(β-carotene hydroxylase，HYD)，以期達(dá)到特異性地提高小麥胚乳

3、中的β-胡蘿卜素含量的目的。
　　(1)番茄紅素的環(huán)化是類(lèi)胡蘿卜素合成通路中的第一個(gè)分支節(jié)點(diǎn)，所以LCYB和番茄紅素ε環(huán)化酶(Lycopeneε-cyclase，LCYE)的活性通常被認(rèn)為可以決定下游類(lèi)胡蘿卜素的含量和最終比例。本實(shí)驗(yàn)室前期在過(guò)表達(dá)CrtB和歐文氏菌類(lèi)胡蘿卜素脫氫酶基因CrtI提高小麥類(lèi)胡蘿卜素含量的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系中內(nèi)源合成酶基因LCYB的高表達(dá)是β-胡蘿卜素積累的關(guān)鍵因素，但到目前為止，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于

4、小麥中LCYB基因的功能以及其與小麥中類(lèi)胡蘿卜素積累相關(guān)的研究報(bào)道，因此本研究首先通過(guò)電子克隆技術(shù)，分離得到了全長(zhǎng)TaLCYB基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析和細(xì)菌互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明了TaLCYB具有番茄紅素環(huán)化酶功能。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，TaLCYB基因在不同組織中有不同的表達(dá)模式，雖然TaLCYB基因在種子發(fā)育后期有較高的表達(dá)水平，但是β-胡蘿卜素的含量仍然呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。另外發(fā)現(xiàn)，TaLCYB基因的表達(dá)強(qiáng)烈地受到強(qiáng)光處理的誘導(dǎo)，β-胡

5、蘿卜素的含量變化和TaLCYB基因的表達(dá)變化相一致。通過(guò)基因干擾的技術(shù)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)小麥中TaLCYB基因的表達(dá)可使β-胡蘿卜素和葉黃素的含量下降并伴隨著番茄紅素的積累，同時(shí)其它相關(guān)的類(lèi)胡蘿卜素合成酶基因的表達(dá)同樣發(fā)生了不同程度的變化，這一研究結(jié)果證明TaLCYB基因在小麥種子β-胡蘿卜素合成過(guò)程中扮演重要的角色并主要控制了維生素A原的合成，同時(shí)決定下游類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)物的流量；這為小麥類(lèi)胡蘿卜素的合成代謝研究提供了新的視角并同時(shí)為進(jìn)一步通過(guò)遺

6、傳代謝工程提高小麥中的β-胡蘿卜素含量提供了新的研究思路，即可通過(guò)干擾下游合成酶基因來(lái)改變代謝平衡從而得到特定類(lèi)胡蘿卜素的積累。
　　(2)類(lèi)胡蘿卜素的遺傳代謝工程是目前一種快速有效提高植物中類(lèi)胡蘿卜含量的方法，但是對(duì)于如何特異性提高β-胡蘿卜素含量的研究報(bào)道仍然較少。通過(guò)對(duì)發(fā)育過(guò)程中的種子進(jìn)行HPLC分析發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素的含量伴隨著種子的成熟度提高而逐漸減少，這個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)正在探索如何在成熟小麥種子的胚乳中特異性積累大量β-胡蘿卜素

7、的研究提供了非常有意義的參考。因?yàn)槿绻覀兛梢愿淖兎N子中的類(lèi)胡蘿卜素的代謝平衡，便可以特異性的積累β-胡蘿卜素。在類(lèi)胡蘿卜素合成代謝過(guò)程中，β-胡蘿卜素羥基化酶在下游的合成通路中扮演了十分重要的角色，它能將具有維生素A原活性的胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)槭ゾS生素A原活性的葉黃素。我們?cè)谘芯縏aLCYB基因功能的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)通過(guò)干擾 TaLCYB基因的表達(dá)可以降低β-胡蘿卜素含量并伴隨著其作用底物番茄紅素的積累，因此如果我們對(duì)β-胡蘿卜素進(jìn)行羥基化作

8、用的酶HYD進(jìn)行干擾便有可能達(dá)到積累β-胡蘿卜素的目的。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)干擾HYD基因的表達(dá)可使β-胡蘿卜素的含量相比對(duì)照株系中的0.167μg g-1提高10.5倍，達(dá)到了1.76μg g-1；過(guò)表達(dá)CrtB基因?yàn)楹铣赏芬胄碌牡孜飳?dǎo)致β-胡蘿卜素提高了14.6倍達(dá)到2.45μg g-1；而過(guò)表達(dá)CrtB基因結(jié)合HYD干擾導(dǎo)致β-胡蘿卜素在小麥胚乳中的大量積累，相比野生型Bobwhite提高了31倍達(dá)到5.06μg g–1。通過(guò)對(duì)不同

9、組合的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是外源CrtB基因的表達(dá)還是HYD基因的干擾都引起不同的內(nèi)源類(lèi)胡蘿卜素合成酶基因表達(dá)的上調(diào)，推測(cè)不同的轉(zhuǎn)基因策略通過(guò)不同的調(diào)控機(jī)制影響內(nèi)源類(lèi)胡蘿卜素合成酶基因的表達(dá)從而影響類(lèi)胡蘿卜素含量的積累。這一研究結(jié)果證明在小麥中可以通過(guò)干擾下游合成酶基因來(lái)改變代謝平衡從而得到特定類(lèi)胡蘿卜素的積累。并結(jié)合過(guò)表達(dá)CrtB基因得到了到目前為止β-胡蘿卜素含量和總類(lèi)胡蘿卜素含量積累最高的小麥轉(zhuǎn)基因株系。