陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)胰島素樣生長因子—1體內(nèi)轉(zhuǎn)基因治療脊髓壓迫性損傷的實驗研究.pdf

1、本實驗應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)胰島素樣生長因子-1對急性脊髓壓迫性損傷展開實驗研究，通過觀察對損傷脊髓神經(jīng)細胞EGFP和IGF-1融合蛋白表達以及RealTimePCR對損傷脊髓組織IGF-1mRNA的定量表達；凋亡相關(guān)基因的免疫組化染色；TUNEL原位末端標(biāo)記測定神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)；以及一氧化氮合酶、特別是損傷脊髓局部誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的測定，探討IGF-1在脊髓損傷修復(fù)中的作用，為轉(zhuǎn)基因治療SCI提供新的策略。 目的：1.構(gòu)建胰島

2、素樣生長因子-1基因的真核表達質(zhì)粒(pEGFP-N1-IGF-1)，觀察其在大鼠損傷脊髓內(nèi)表達，并進行定量分析； 2.探討陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)重組pEGFP-N1-IGF-1體內(nèi)轉(zhuǎn)基因?qū)顾钃p傷后神經(jīng)功能的影響及其機制； 3.陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)重組pEGFP-N1-IGF-1體內(nèi)轉(zhuǎn)基因預(yù)處理對脊髓損傷后NOS和iNOS影響，進一步探討轉(zhuǎn)基因治療SCI的機制。 方法：1.應(yīng)用RT-PCR方法從大鼠肝臟組織總RNA中提取并

3、擴增IGF-1基因的全長cDNA，并將該基因連接克隆到含有綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的真核表達載體pEGFP-N1上，以構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IGF-1； 2.利用改良Nystr(o)m's壓迫法建立大鼠脊髓不完全損傷動物模型； 3.利用基因直接注射法，將陽離子脂質(zhì)體與重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IGF-1混合后注射的大鼠脊髓損傷部位，以空白質(zhì)粒及生理鹽水對照，轉(zhuǎn)染一周后取材，行冰凍切片并于熒光顯微鏡下觀察綠

4、色熒光蛋白表達情況；行RealTimePCR檢測脊髓內(nèi)IGF-1的mRNA定量表達，并進行統(tǒng)計學(xué)分析； 4.應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體Transfectamreagent介導(dǎo)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IGF-1在大鼠脊髓內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠脊髓神經(jīng)細胞，于脊髓損傷后不同時間點，利用功能檢測、免疫組化、原位雜交及電鏡檢查手段，研究胰島素樣生長因子-1(IGF-1)基因?qū)顾鑹浩刃該p傷后神經(jīng)功能的影響； 5.應(yīng)用重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IGF

5、-1預(yù)處理大鼠后，并于脊髓損傷后不同時間點觀察血清NOS含量及局部脊髓組織iNOS含量變化，研究胰島素樣生長因子-1(IGF-1)對脊髓壓迫性損傷后NOS及iNOS的影響以及時序變化。 結(jié)果：1.實驗從大鼠肝臟組織中提取總RNA，以RT-PCR方法獲取編碼胰島素樣生長因子-1(IGF-1)基因的全序列cDNA。構(gòu)建IGF-1cDNA真核表達質(zhì)粒時將能發(fā)出綠色熒光的EGFP報告基因融合在IGF-1基因，并通過雙酶切后DNA電泳鑒定

6、及DNA測序證實。 2.本實驗應(yīng)用脊髓內(nèi)直接注射法，通過陽離子脂質(zhì)體Transfectamreagent成功介導(dǎo)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IGF-1在大鼠脊髓內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠脊髓神經(jīng)細胞，并表達EGFP和IGF-1的融合蛋白，EGFP基因可作為報告基因觀察IGF-1基因在體內(nèi)的表達，通過RealTimePCR方法進行mRNA定量分析進一步證實了，重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IGF-1能在脊髓內(nèi)明確地表達IGF-1，pEGFP-N1-IG

7、F-1轉(zhuǎn)基因組與IGF-1組和對照組mRNA表達相對數(shù)比較均有明顯顯著性差異(P＜0.01)。 3.應(yīng)用改良Nystr(o)m's大鼠脊髓損傷模型，通過對后肢神經(jīng)功能評定，在脊髓損傷后不同時間點pEGFP-N1-IGF-1轉(zhuǎn)基因組和IGF-1組分別與對照組比較，評定結(jié)果均有顯著性差異(P＜0.01)，且pEGFP-N1-IGF-1轉(zhuǎn)基因組與IGF-1組之間也存在顯著性差異(P＜0.05)。 4.各實驗組各觀察時間點進行B

8、cl-2、Bax免疫組化染色結(jié)果顯示：pEGFP-N1-IGF-1轉(zhuǎn)基因組、IGF-1組分別與SAL對照組進行比較在24h、3d、7d、14d和28d存在顯著性差異(P＜0.05)，特別在24h、3d、7d存在特別顯著性差異(P＜0.01)。pEGFP-N1-IGF-1轉(zhuǎn)基因組與IGF-1組在24h-7d也存在顯著性差異(P＜0.05)。 5.各實驗組各觀察時間點TUNEL法原位雜交結(jié)果顯示：pEGFP-N1-IGF-1轉(zhuǎn)基因組

9、、IGF-1組以及SAL對照組形態(tài)學(xué)觀察：陽性染色白質(zhì)及灰質(zhì)均存在，多發(fā)生在神經(jīng)膠質(zhì)細胞，在神經(jīng)元細胞也存在表達陽性的細胞。pEGFP-N1-IGF-1轉(zhuǎn)基因組、IGF-1組分別與SAL對照組進行比較在12h、24h、3d、7d、14d和28d存在特別顯著性差異(P＜0.01)。pEGFP-N1-IGF-1轉(zhuǎn)基因組與IGF-1組在3d、14d、28d也存在顯著性差異(P＜0.05)。 6.正常對照組中血清NOS活性為18.32±

10、3.12U/ml；脊髓iNOS活性為4.35±1.04U/mgprot。各組在損傷后1-8h含量迅速升高，并于8-24小時達到高峰，其后逐漸降低，1-2w后維持在較高水平，pEGFP-N1-IGF-1轉(zhuǎn)基因組各個時間點血清NOS活性及脊髓iNOS活力較對照組明顯降低(P＜0.05)，各組隨時間變化趨勢基本一致。 結(jié)論：1.實驗構(gòu)建IGF-1cDNA真核表達質(zhì)粒時將能發(fā)出綠色熒光的EGFP報告基因融合在IGF-1基因中，從蛋白表達

11、水平及mRNA定量結(jié)果證實，重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IGF-1能在脊髓內(nèi)明確地表達IGF-1。證明陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的IGF-1體內(nèi)轉(zhuǎn)基因方法的可行性，為今后應(yīng)用IGF-1基因治療脊髓損傷奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。 2.陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)IGF-1基因轉(zhuǎn)染能夠明顯上調(diào)凋亡相關(guān)基因Bcl-2表達，同時降低Bax的表達，促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖的同時抑制神經(jīng)細胞的凋亡壞死，并促進了大鼠后肢功能的恢復(fù)，電鏡檢查的結(jié)果及原位雜交TUNEL末端標(biāo)記

12、對凋亡指數(shù)結(jié)果也證實，IGF-1基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染能夠促進脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。 3.陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)IGF-1基因轉(zhuǎn)染預(yù)處理能夠有效地下調(diào)大鼠一氧化氮合酶(NOS)活性，特別是脊髓局部誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的活性，從而減輕繼發(fā)性損傷所致的神經(jīng)組織的損害，有效地改善神經(jīng)功能。 4.IGF-1對于促進SCI功能恢復(fù)作用可能的機制是：(1)促進少突膠質(zhì)細胞的增殖、生長、發(fā)育；(2)減少脊髓繼發(fā)性損傷所致的神經(jīng)細胞，特別

13、是少突膠質(zhì)細胞的凋亡和死亡，抑制炎癥細胞進入CNS；(3)IGF-1可有效地下調(diào)iNOS的活性，從而起保護作用。 5.目前神經(jīng)功能恢復(fù)狀況和組織學(xué)結(jié)果和理想狀態(tài)尚有差距，仍有一些問題應(yīng)進一步深入探討：(1)提高轉(zhuǎn)基因治療的轉(zhuǎn)染率，調(diào)節(jié)合理的表達時間及用藥途徑；(2)應(yīng)用IGF-1體內(nèi)轉(zhuǎn)基因?qū)τ谒枨试偕吧窠?jīng)纖維生長方面的作用；(3)幾種基因治療的聯(lián)合應(yīng)用，包括神經(jīng)營養(yǎng)因子的轉(zhuǎn)入?yún)f(xié)同神經(jīng)干細胞移植、神經(jīng)營養(yǎng)因子轉(zhuǎn)入?yún)f(xié)同相關(guān)抑制因子