胰島素樣生長因子-1對氧化損傷的Schwann細(xì)胞抗凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：施萬細(xì)胞(Schwann cell，SCs)是周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，是周圍神經(jīng)系統(tǒng)特有的一種膠質(zhì)細(xì)胞，在神經(jīng)損傷后的再生和功能恢復(fù)中起著重要的作用。長期以來，周圍神經(jīng)病變嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量，是神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域中的一個復(fù)雜但十分重要的病變過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)理之一是氧化應(yīng)激引起氧自由基增多，從而導(dǎo)致了Schwann細(xì)胞的凋亡。Schwann細(xì)胞能夠包繞軸突形成有髓纖維或無髓纖維，并分泌多種神經(jīng)因子參與神經(jīng)系

2、統(tǒng)的發(fā)育和損傷后的再生。因此，越米越多的研究通過施加外界因素(如各種神經(jīng)生長因子、中藥、電磁場、硅膠管及其他移植物等)干預(yù)Schwann細(xì)胞的生存環(huán)境，探討能夠促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的再生過程的適宜方法。 目前，應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育的研究已經(jīng)得到人們廣泛的認(rèn)可。胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth fctor-1，IGF-1)是一種肽能神經(jīng)生長因子，與組織分化、增殖和成熟密切相關(guān)。IGF-1具

3、有非選擇性神經(jīng)營養(yǎng)作用，能促進(jìn)外周神經(jīng)再生。體外研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1對各種中樞神經(jīng)細(xì)胞均有神經(jīng)營養(yǎng)和保護(hù)作用，能夠影響神經(jīng)細(xì)胞的生長、存活和分化。同時，大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IGF-1對多種刺激因素(如缺血、缺氧，氧化應(yīng)激等)引起的細(xì)胞凋亡有抑制作用。IGF-1的抗氧化作用已有初步研究，但對周圍神經(jīng)中Schwann細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用的機(jī)理尚未見報道。 本課題通過建立過氧化氫誘導(dǎo)的Schwann細(xì)胞氧化損傷模型，并在此模型的基礎(chǔ)上，觀

4、察了神經(jīng)因子IGF-1對氧化損傷的Schwann細(xì)胞的保護(hù)作用，通過MTT、生化檢測、吖叮橙染色、Western blot等方法進(jìn)行細(xì)胞活力測定、酶活力分析、凋亡率的分析以及凋亡蛋白Bc1-2表達(dá)水平的測定，探討IGF-1抗氧化損傷、抗凋亡的作用機(jī)理，為揭示IGF-1治療周圍神經(jīng)病變的機(jī)制提供理論依據(jù)。 方法：本課題從新生一周內(nèi)Wistar大鼠的坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)獲取Schwann細(xì)胞，用含10％胎牛血清(FCS)的DMEM/F

5、12培養(yǎng)液于5％CO2、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Schwann細(xì)胞培養(yǎng)72小時后，分為3個實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)一空白對照組。 1．大體觀察在加入H2O2損傷因素與IGF-1保護(hù)因素后12h時，倒置相差顯微鏡下觀察Schwarm細(xì)胞的大體形態(tài)、貼壁數(shù)量和生長狀態(tài)等情況，并照相記錄。 2．Schwann細(xì)胞的純化及鑒定利用傳代法純化Schwann細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前Schwann細(xì)胞爬片作S-100免疫組化染色，鑒定Schwan

6、n細(xì)胞。 3．實(shí)驗(yàn)分組將培養(yǎng)細(xì)胞分為3組：①過氧化氫損傷組：在培養(yǎng)基中加入終濃度為100μmol/L的H2O2；②IGF-1保護(hù)組：100μmol/L的H2O2+100μg/ml的IGF-1；③正常組(不加任何因素)；同時設(shè)立僅加培養(yǎng)液的空白對照組。 4．MTT法進(jìn)行胰島素樣生長因子-1(IGF-1)抗過氧化氫氧化損傷的作用分析。 5．生化檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物MDA和超氧化物歧化酶SOD的水平。 6．應(yīng)

7、用吖叮橙熒光染色觀察、比較過氧化氫損傷組、IGF-1保護(hù)組和正常對照組細(xì)胞的存活、凋亡情況。 7．正常對照組、過氧化氫損傷組和IGF-1保護(hù)組細(xì)胞提取總蛋白，通過SDS-PAGE及蛋白印跡(Western blot)檢測凋亡蛋白Bcl一2的表達(dá)水平變化情況。 通過以上的實(shí)驗(yàn)，建立了過氧化氫誘導(dǎo)Schwann細(xì)胞的氧化損傷模型，在此模型的基礎(chǔ)上探討IGF-1對Schwann細(xì)胞抗氧化損傷、抗凋亡的作用機(jī)理。 結(jié)果：

8、剛接種的原代Schwann細(xì)胞呈圓形，懸浮在培養(yǎng)液中，接種6h后大部分細(xì)胞貼壁，部分細(xì)胞開始呈橢圓形，24h后變成雙極，胞體飽滿，立體感強(qiáng)，少數(shù)呈三角形，伸出三個突起。培養(yǎng)48～72h后，出現(xiàn)聚合現(xiàn)象，許多細(xì)胞聚合在一起，呈端對端、肩并肩、漩渦狀或柵欄狀排列，在細(xì)胞密度較低時，則聚集成堆，形成“細(xì)胞島”，免疫細(xì)胞化學(xué)染色為S-100陽性；另一種細(xì)胞稍大，外形不規(guī)則，星扁平狀，突起短而多，核較淺，為成纖維細(xì)胞，所占比例較低。培養(yǎng)72小時后

9、進(jìn)行傳代、純化Schwann細(xì)胞，鏡下觀察Schwann細(xì)胞的純度明顯增加，免疫化學(xué)染色顯示80％以上的細(xì)胞S-100呈陽性反應(yīng)。加入H2O2 12小時后，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞突起萎縮，胞體腫脹變圓、空泡化變，細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞脫壁，漂浮于培養(yǎng)液中，胞體立體感差，折光度下降，并可見大量細(xì)胞碎片：IGF-1保護(hù)組的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，突起伸展，細(xì)胞存活數(shù)量多，胞體較飽滿、立體感較強(qiáng)，少見細(xì)胞皺縮破碎現(xiàn)象，但細(xì)胞

10、聚團(tuán)現(xiàn)象較明顯；正常組的細(xì)胞胞體梭形、折光度好，突起較長，細(xì)胞數(shù)量明顯較多，偶有漂浮死細(xì)胞。 不同實(shí)驗(yàn)組檢測結(jié)果如下： 1．MTT法檢測IGF-1抗氧化損傷的作用分析表明：IGF-1可明顯拮抗過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷，與過氧化氫損傷組相比，IGF-1保護(hù)組可維持較高的細(xì)胞存活率，二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時，IGB-1保護(hù)組的細(xì)胞存活率低于正常組，二者之間亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2．生化指標(biāo)SOD檢測結(jié)果表

11、明：與過氧化氫損傷組相比，IGF-1保護(hù)組細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)維持在較高的活力水平，表明IGF-1可明顯拮抗過氧化氫引起的SOD降低；同時低于正常對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3．生化指標(biāo)MDA檢測結(jié)果表明：與正常組相比，過氧化氫引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的大量堆積，即MDA含量增加；而IGF-1可明顯降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的含量(P<0.05)。 4．吖叮橙熒光染色法在熒光顯微鏡下觀察到，發(fā)生凋亡的陽性

12、細(xì)胞呈圓形，體積明顯縮小，細(xì)胞核內(nèi)可見致密濃染的黃色熒光和凋亡小體，胞質(zhì)為火焰樣橘紅色熒光；正常組的Schwann細(xì)胞呈梭形，胞核圓形、橢圓形，呈亮綠色，胞質(zhì)為灰綠色和橙紅色，亦可見少量的凋亡前期細(xì)胞。損傷組細(xì)胞量明顯減少，凋亡形態(tài)典型；保護(hù)組存活細(xì)胞量增多，細(xì)胞狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。 5．蛋白印跡Western blot顯示抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)情況：過氧化氫損傷組細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)，而加入IGF-1保護(hù)后B

13、cl-2蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，正常組的蛋白表達(dá)量最高。 結(jié)論：我們以原代培養(yǎng)的Schwann細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，利用過氧化氫誘導(dǎo)Schwann細(xì)胞建立氧化損傷模型，在此基礎(chǔ)上，觀察過氧化氫誘導(dǎo)Schwann細(xì)胞的氧化損傷作用及神經(jīng)因子IGF-1對氧化損傷的Schwann細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過氧化氫損傷能夠引起細(xì)胞內(nèi)自由基的增多，SOD活力的降低，脂質(zhì)過氧化物的增多，并且自由基的增多能通過信號通路上抑制凋亡蛋白Bcl

14、-2的表達(dá)而最終引起細(xì)胞的凋亡；IGF-1不僅能降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物(MDA)的含量，維持細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的含量，還能通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)來抑制細(xì)胞死亡的發(fā)生，證明IGF-1可以明顯拮抗過氧化氫對Schwann細(xì)胞的氧化損傷作用。 本研究探討了IGF-1對Schwann細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，從氧化損傷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面探討了IGF-1的抗氧化、抗凋亡作用的分子機(jī)制，為研究周圍神經(jīng)病變中自由基的分子作