STGC3基因抑瘤機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分STGC3基因表達(dá)上調(diào)對(duì)CNE2細(xì)胞系蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響 目的：STGC3基因是與鼻咽癌相關(guān)候選抑瘤基因(GenBank登錄號(hào)為AY078383)。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，探討STGC3基因表達(dá)上調(diào)后，對(duì)體外培養(yǎng)的人鼻咽癌CNE2細(xì)胞系蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響，從而了解該基因在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的地位和作用。方法：分別抽提CNE2、轉(zhuǎn)染空白載體的CNE2和穩(wěn)定表達(dá)STGC3基因的CNE2細(xì)胞的總蛋白，利用雙向凝膠電泳(Two-

2、dimensionalelectrophoresis，2-DE)方法，分離三種細(xì)胞系的總蛋白質(zhì)，凝膠經(jīng)染色后，采用ImageMaster圖像分析軟件進(jìn)行比較分析、識(shí)別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定，得到相應(yīng)

3、的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptidemassfingerprint，PMF)，數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。結(jié)果：圖象掃描后用ImageMaster軟件分析，統(tǒng)計(jì)CNE2、pcDNA3.1(+)/CNE2和pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2細(xì)胞二維電泳圖譜的蛋白質(zhì)點(diǎn)，3種細(xì)胞的蛋白質(zhì)點(diǎn)分別為675±27、660±23和662±18個(gè)，并且蛋白質(zhì)點(diǎn)主要分布在等電點(diǎn)為3.5-8.5，分子量為22kD-80kD的范圍內(nèi)，在STGC3

4、基因高表達(dá)后，90-95％的蛋白質(zhì)表達(dá)與對(duì)照組一致，5-10％的蛋白質(zhì)為差異表達(dá)，表明STGC3基因的穩(wěn)定表達(dá)，可導(dǎo)致CNE2細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變。去除空白載體所致的蛋白質(zhì)的差異后，確立了23個(gè)由于STGC3基因高表達(dá)所致的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。其中15個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。將差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行原位酶解后，上質(zhì)譜分析，獲得相關(guān)蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜，經(jīng)Mascot軟件進(jìn)

5、行相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，初步鑒定出18種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。其中CyclophilinA、PPIA、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶、α-烯醇酶、nM23蛋白假定蛋白FLJ11811、IGH@protein、脂肪酸結(jié)合蛋白、免疫球蛋白重鏈、α-復(fù)合蛋白1、Cofilin、TPMsk3、電壓依賴性陰離子通道蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而假定蛋白FLJ11811、人硫氧還蛋白、磷酸甘油酸變位酶、人組胺釋放因子、proteasomeendopeptidasecomplex

6、、異質(zhì)核核糖核蛋白F則表達(dá)下調(diào)。這些差異蛋白質(zhì)與凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)。結(jié)論：1.STGC3基因高表達(dá)，能引起鼻咽癌細(xì)胞系CNE2蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變。2.STGC3基因高表達(dá)，使CNE2細(xì)胞系CyclophilinA、α-烯醇酶、nM23等蛋白表達(dá)上調(diào)，hnRNPF、Thioredoxin等蛋白表達(dá)下調(diào)，這些蛋白質(zhì)的表達(dá)改變涉及細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞免疫等?！　〉诙糠执萍に貙?duì)轉(zhuǎn)染STGC3基因的CNE2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作

7、用及蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響 目的：前期研究發(fā)現(xiàn)，種植轉(zhuǎn)染STGC3基因CNE2細(xì)胞組的4只裸鼠中，2只雌性鼠的荷瘤腫塊明顯小于同組的2只雄性鼠，提示雌激素可能具有促進(jìn)STGC3基因的抑瘤作用。本文旨在進(jìn)一步探討雌激素在STGC3基因的抑瘤過程中可能發(fā)揮的作用。方法：采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)法，觀察雌二醇(17-β-E2)對(duì)CNE2細(xì)胞系及pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2細(xì)胞系生長(zhǎng)的影響。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)，如

8、二維電泳、圖像分析、質(zhì)譜技術(shù)等方法，分析雌二醇對(duì)pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2細(xì)胞系蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響。結(jié)果：(1)MTT法測(cè)定結(jié)果顯示，用0.001-10μmol/L的17-β-E2處理CNE2細(xì)胞后，CNE2細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制，抑制率為6.0％-35.7％，與對(duì)照組相比，差異均有顯著性意義(p＜0.05)，而用上述濃度的17-β-E2處理pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2細(xì)胞后，其抑制率明顯提高，為18.9％-

9、57.7％，且呈濃度依賴關(guān)系，各處理組與對(duì)照組之間差異有顯著性意義(p＜0.05)。分析不同濃度的17-β-E2對(duì)CNE2和pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2細(xì)胞的抑制率，兩者比較，差異有顯著性意義(p＜0.05)，說明雌二醇能夠增強(qiáng)STGC3基因?qū)NE2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。(2)抽提雌二醇處理前后的CNE2、pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2細(xì)胞四種樣品的總蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳，獲得重復(fù)性較好的雙向電泳銀染圖譜，經(jīng)

10、掃描成像及PDQuest軟件分析，在CNE2、pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2和雌二醇處理后的CNE2、pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2細(xì)胞系中分別檢測(cè)到662±38、682±43和645±56、657±61個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。通過兩兩匹配分析后，在經(jīng)雌二醇處理后的pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2細(xì)胞系中，確立了28個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)主要為低豐度蛋白質(zhì)。在差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)中選擇清晰、較濃的

11、點(diǎn)做好標(biāo)記，從凝膠上準(zhǔn)確切割后，進(jìn)行脫色、酶解、肽片段的提取，獲得相關(guān)蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜，經(jīng)Mascot軟件上相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，初步鑒定出其中的10個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，涉及細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞免疫、細(xì)胞周期調(diào)控等。結(jié)論：1.雌二醇能夠增強(qiáng)STGC3基因?qū)NE2細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用。2.雌二醇處理pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2細(xì)胞后，T細(xì)胞受體、PPIA、核基質(zhì)蛋白238及Stratifin蛋白的表達(dá)上調(diào)，PCNA、hnRNPB1、