鼻咽癌中STGC3基因的表達(dá)及調(diào)控其表達(dá)CNE2細(xì)胞系的建立.pdf

1、第一部分 STGC3蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其意義
　　目的:通過觀察STGC3蛋白質(zhì)在鼻咽癌和正常鼻咽活檢組織中的表達(dá)及分布情況,探討STGC3在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:首先制備兔抗人STGC3多克隆抗體;運(yùn)用免疫組化SP方法,檢測(cè)40例鼻咽癌組織及21例正常鼻咽組織中STGC3蛋白的表達(dá)與定位;運(yùn)用Western blot法,檢測(cè)20例鼻咽癌和20例正常鼻咽活檢標(biāo)本中STGC3蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
　　

2、結(jié)果:
　　(1)免疫組化結(jié)果:正常鼻咽粘膜組織STGC3蛋白定位于上皮細(xì)胞胞核及胞漿,陽性表達(dá)率為85.71％(18/21),鼻咽癌中 STGC3主要在癌細(xì)胞的胞漿表達(dá),胞核表達(dá)較少,陽性表達(dá)率為30.00%(12/40),明顯低于正常對(duì)照組織,差異具有顯著性,P<0.05;鼻咽癌 STGC3陽性表達(dá)率在臨床Ⅰ-Ⅱ期(43.75%)明顯高于Ⅲ-Ⅳ期(20.83%),且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌病例其陽性率(38.10%)明顯高于有淋巴

3、結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌病例陽性表達(dá)率(21.05%),P<0.05;(2)Western blot結(jié)果:鼻咽癌 STGC3相對(duì)表達(dá)量(STGC3/actin)明顯低于對(duì)照正常組織(0.324±0.185;0.978±0.213),P<0.05。
　　結(jié)論:STGC3蛋白在正常鼻咽粘膜和鼻咽癌中定位于細(xì)胞的胞核及胞漿。正常鼻咽粘膜和鼻咽癌STGC3的表達(dá)水平及定位有差別,鼻咽癌組織中STGC3蛋白的表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組織,且鼻咽癌中核

4、表達(dá)減少。 STGC3陽性表達(dá)率與鼻咽癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)密切相關(guān),臨床分期越早,表達(dá)率越高,且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌病例陽性率明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌病例,表明STGC3表達(dá)下調(diào)或缺失在鼻咽癌的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中起一定作用。
　　第二部分 Tet調(diào)控STGC3基因表達(dá)CNE2細(xì)胞系建立及其功能初步研究
　　目的:本研究利用Tet-on調(diào)控系統(tǒng),建立受強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)STGC3基因表達(dá)的CNE2細(xì)胞系,為進(jìn)一步研究STGC3

5、基因功能提供一個(gè)理想的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　方法:構(gòu)建重組真核表達(dá)載體 pRevTRE-STGC3;先后將調(diào)控質(zhì)粒 pRevTet-on和反應(yīng)質(zhì)粒pRevTRE-STGC3轉(zhuǎn)染入CNE2細(xì)胞,并用G418和潮霉素分別進(jìn)行兩輪篩選,以1mg/LDox誘導(dǎo),運(yùn)用RT-PCR選擇高誘導(dǎo)活性、低背景的細(xì)胞克隆。用不同濃度強(qiáng)力霉素(Doxcycline, Dox)誘導(dǎo)CNE2/Tet/TRE-STGC細(xì)胞, RT-PCR和Western blot

6、法檢測(cè)STGC3的表達(dá),確定Dox的最佳誘導(dǎo)濃度。用此濃度 Dox分別誘導(dǎo)CNE2、CNE2/Tet/TRE、CNE2/Tet/TRE-STGC3三組細(xì)胞,通過HE染色、繪制生長(zhǎng)曲線、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀分析等方法,觀察STGC3基因高表達(dá)后CNE2細(xì)胞形態(tài)、增殖速度、克隆形成率和細(xì)胞周期分布變化。
　　結(jié)果:CNE2/Tet/TRE-STGC細(xì)胞對(duì)Dox誘導(dǎo)敏感,并且STGC3基因表達(dá)呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性,Dox的最佳

7、誘導(dǎo)濃度是3mg/L。以3mg/LDox誘導(dǎo)CNE2、CNE2/Tet/TRE、CNE2/Tet/TRE-STGC3三組細(xì)胞:顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)顯示轉(zhuǎn)基因組細(xì)胞核漿比例減少;繪制生長(zhǎng)曲線表明轉(zhuǎn)基因組較CNE2組和轉(zhuǎn)空載體組生長(zhǎng)速度減慢,P<0.05;軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)顯示CNE2組、空載體組、轉(zhuǎn)STGC3基因組克隆形成率分別為(36±2.5)%、(34±3.1)%、(10±2.7)%,轉(zhuǎn)STGC3基因組克隆形成能力較兩對(duì)照組顯著降低(