條滸苔轉(zhuǎn)化表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、本文從三方面對(duì)條滸苔轉(zhuǎn)化表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行研究：條滸苔原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與再生系統(tǒng)研究、條滸苔細(xì)胞轉(zhuǎn)化表達(dá)選擇標(biāo)記的篩選和條滸苔外源基因?qū)肱c轉(zhuǎn)化表達(dá)系統(tǒng)的建立。 本實(shí)驗(yàn)首先建立了條滸苔原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與再生技術(shù)，探索了條滸苔原生質(zhì)體分離優(yōu)化條件，發(fā)現(xiàn)用酶法獲得條滸苔原生質(zhì)體時(shí)，最佳酶液配方為2％纖維素酶混合2％離析酶，最佳酶解pH為6.5，滲透劑甘露醇濃度為0.6M。通過(guò)原生質(zhì)體培養(yǎng)，觀察到條滸苔細(xì)胞3種再生發(fā)育方式：(1)單細(xì)胞可以

2、直接分裂生長(zhǎng)形成單細(xì)胞苗，有的小苗橫裂為8細(xì)胞苗后形成有分枝的苗；(2)某些單細(xì)胞以不規(guī)則方式進(jìn)行分裂，形成細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞可以釋放出來(lái)形成小苗，并形成小苗簇；(3)某些單細(xì)胞分裂只是在原細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，原細(xì)胞即成為孢子囊/配子囊，其子細(xì)胞不形成壁，即為孢子/配子。一個(gè)孢子囊/配子囊中可含有10個(gè)以上的子細(xì)胞，子細(xì)胞大小不均一。高光強(qiáng)(45μmolm-2.s-1)、高溫(20℃)和充氣等外界條件下，條滸苔細(xì)胞更易于形成孢子囊/配子囊，

3、并放散孢子/配子。 其次本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了條滸苔細(xì)胞轉(zhuǎn)化表達(dá)選擇標(biāo)記的篩選，研究表明條滸苔原生質(zhì)體對(duì)氯霉素敏感性較高，而對(duì)氨芐西林鈉、羧芐西林鈉、硫酸卡那霉素、G-418、硫酸鏈霉素不敏感。當(dāng)氯霉素濃度高達(dá)125μg/ml時(shí)，原生質(zhì)體培養(yǎng)兩周大部分死亡。然后比較了條滸苔對(duì)氯霉素和除草劑Basta敏感性，采用不同濃度氯霉素(0、25、50、75、100、125μg/ml)和Basta(0、5、12.5、25、37.5、50μg/ml)分

4、別對(duì)條滸苔游孢子、小苗和成體葉片細(xì)胞的殺生作用進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，在15天內(nèi)氯霉素最大濃度125μg/ml對(duì)條滸苔游孢子、小苗和成體葉片細(xì)胞均難以達(dá)到全部殺死效果，其存活率分別為1％、20％和25％；而B(niǎo)asta對(duì)條滸苔具有很強(qiáng)的殺生作用，在12.5μg/ml濃度下，Basta在11天內(nèi)可將條滸苔小苗和成體葉片全部殺死；在25μg/ml濃度下，Basta在7天內(nèi)可將條滸苔小苗和成體葉片全部殺死；對(duì)于條滸苔游孢子，5μg/mlBasta

5、3天內(nèi)就可以使其全部死亡。這個(gè)結(jié)果提示了bar基因有可能成為滸苔基因工程較理想的選擇標(biāo)記基因。 最后，本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展了條滸苔外源基因?qū)肱c轉(zhuǎn)化表達(dá)系統(tǒng)建立的研究。采用PEG法轉(zhuǎn)化三種外源DNA分別含有報(bào)告基因LacZ基因和GUS基因以及選擇抗性基因bar基因。經(jīng)組織化學(xué)染色檢測(cè)，LacZ基因未見(jiàn)表達(dá)，而GUS基因在第3天獲得瞬間表達(dá)。通過(guò)40天Basta壓力篩選，轉(zhuǎn)化藻株仍然具有Basta抗性；對(duì)經(jīng)過(guò)30天Basta篩選的小苗進(jìn)行P