脆性位點(diǎn)基因FHIT與WWOX在卵巢上皮性癌中的研究.pdf

1、惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病，也是導(dǎo)致病人死亡的主要原因。卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率約占5～7/10萬，且近十年來我國卵巢癌發(fā)病率有明顯上升趨勢。由于卵巢癌特殊的解剖和組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及早期發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的特性，就診時(shí)2/3的患者已屬晚期，多見有腹水及廣泛的種植轉(zhuǎn)移，5年生存率徘徊于30％左右，病死率居?jì)D科惡性腫瘤首位。卵巢癌已成為嚴(yán)重威脅女性生命和健康的主要腫瘤，因此卵巢癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

2、 FHIT基因是1996年Ohta<'[1]>等以外顯子捕獲法(exon trapping experiment) 在3p14.2區(qū)域定位的一個(gè)基因，屬于組氨酸三聯(lián)體(histidine triad，HIT)基因家族，因易于斷裂，故命名為脆性三聯(lián)組氨酸基因(FHIT)，覆蓋FRA3B脆性位點(diǎn)。WWOX基因是2000年由Bednarek<'[2]>等應(yīng)用鳥槍基因測序技術(shù)對相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行分析而分離鑒定出的一個(gè)新基因，它位于染色體16

3、q23.3-24.1區(qū)域，跨越常見染色體脆性位點(diǎn)FRAl6D。FHIT。基因和WWOX基因分別是活躍的第一和第二位脆性位點(diǎn)基因，它們有許多共同點(diǎn)，其中包括：都是位于脆性位點(diǎn)內(nèi)大于1Mb的大基因；在多種人類腫瘤中都存在高頻率的等位基因丟失區(qū)域；腫瘤中都有異常的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。 FHIT基因和WWOX基因作為較早確定且與脆性位點(diǎn)相聯(lián)系的抑癌基因，在抑癌基因家族中的地位舉足輕重。大量文獻(xiàn)證實(shí)FHIT基因和WWOX基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，

4、與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。本文旨在： 1、探討FHIT基因和WWOX基因在人卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)與卵巢上皮性癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系；通過多因素分析，篩選出卵巢上皮性癌轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素；生存分析法分析FHIT基因和WWOX基因的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，從而為臨床治療、隨診以及判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。 2、通過觀察脫甲基藥物5—脫氧雜氮胞苷作用后卵巢癌細(xì)胞A2780的形態(tài)、生長情況、凋亡率及FHIT基因和WWOX基因表達(dá)的變化，為卵

5、巢上皮性癌的臨床治療和進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定理論基礎(chǔ)。第一部分脆性位點(diǎn)基因FHITmRNA與WWoXmRNA在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及臨床意義 目的：通過對不同年齡、組織類型、臨床分期、病理分級、雌孕激素受體、淋巴結(jié)(或遠(yuǎn)處)轉(zhuǎn)移以及有無癌性腹水的卵巢上皮性癌組織中FHIT基因和WWOX基因表達(dá)進(jìn)行研究，探討FHIT基因和WWOX基因表達(dá)與卵巢癌臨床病理各相關(guān)因素的關(guān)系。分析卵巢上皮性癌轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，及FHIT基因和WWOX基因

6、的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。 方法：以β-actin為內(nèi)參照，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測卵巢上皮性癌和正常卵巢組織中脆性位點(diǎn)抑癌基因FHITmRNA與WWOXmRNA的表達(dá)，半定量分析電泳結(jié)果。以免疫組化法檢測卵巢上皮性癌石蠟標(biāo)本中雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)的表達(dá)情況?；虮磉_(dá)與臨床病理各因素之間關(guān)系的分析采用秩和檢驗(yàn)；卵巢上皮性癌轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素的分析采用多元二項(xiàng)分類Logistic回歸分析，計(jì)算各危險(xiǎn)因

7、素的危險(xiǎn)度(OR值)及95％可信區(qū)間(95％CI)，并分析各危險(xiǎn)因素與卵巢上皮性癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。Kaplan meier生存分析法分析FHIT基因和WWOX基因表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果：1、在卵巢上皮性癌中，F(xiàn)HIT基因和WWOX基因弱表達(dá)或無表達(dá)率分別為31.3％(15/48)、39.6％(19/48)，正常卵巢組織中FHIT基因和WWOX基因均為正常表達(dá)。2、FHITmRNA與WWOXmRNA在卵巢上皮性癌組織中的

8、低表達(dá)有明顯相關(guān)性(P<0.05)。3、FHITmRNA與WWOXmRNA的表達(dá)與臨床分期呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。4、WWOXmRNA的表達(dá)缺失與PR表達(dá)陰性有相關(guān)性(P<0.05)。5、多因素分析結(jié)果顯示，F(xiàn)HIT基因或WWOX基因表達(dá)缺失患者、腫瘤分化差者及有癌性腹水者發(fā)生轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性增加，而年齡和組織學(xué)類型與腫瘤的轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性。6、WWOX基因的表達(dá)與患者預(yù)后有顯著相關(guān)性。 結(jié)論：1、FHITmRNA與WWOXmRN

9、A表達(dá)缺失與卵巢上皮性癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，檢測其表達(dá)水平對早期診斷卵巢癌及判斷卵巢癌的臨床進(jìn)展有一定的參考價(jià)值。2、FHITmRNA與WWOXmRNA表達(dá)情況、腫瘤的組織學(xué)分級以及有無癌性腹水是卵巢上皮性癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，年齡和組織學(xué)類型與腫瘤的轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性。3、WWOXmRNA的表達(dá)與患者預(yù)后有顯著相關(guān)性。 第二部分脫甲基藥物對卵巢癌細(xì)胞株A2780中脆性位點(diǎn)基因FHIT和WWOX表達(dá)的影響 目的：研究脫甲基

10、藥物5-脫氧雜氮胞苷(5-Aza-2-deoxyeytidine)對人卵巢上皮性癌細(xì)胞株A2780的生長抑制作用，及其對A2780細(xì)胞中脆性位點(diǎn)抑癌基因FHIT與WWOX表達(dá)的影響，初步探討其作用機(jī)制。 方法：采用5-脫氧雜氮胞苷作用于卵巢上皮性癌細(xì)胞株A2780，倒置顯微鏡下觀察A2780細(xì)胞形態(tài)的改變；M1vr檢測5-脫氧雜氮胞苷對A2780細(xì)胞生長抑制的情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞調(diào)亡率；采用RT-PCR的方法檢測脫甲基藥物作

11、用后A2780細(xì)胞中抑癌基因FHITmRNA與WWOXmRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果：1、倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)脫甲基藥物5-脫氧雜氮胞苷抑制卵巢癌細(xì)胞A2780的生長，可見細(xì)胞核固縮、深染以及出現(xiàn)凋亡小體，細(xì)胞計(jì)數(shù)減少。2、MTT檢測顯示5-脫氧雜氮胞苷抑制A2780細(xì)胞的生長，呈劑量相關(guān)性。3、流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果示藥物作用后細(xì)胞調(diào)亡率明顯增高。4、RT-PCR檢測結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)目的電泳條帶，提示脫甲基藥物5-脫氧雜氮胞苷可促使