PITX2、β-catenin在卵巢上皮性癌中的表達及意義.pdf

1、卵巢上皮性癌是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤之首。卵巢深居盆腔，卵巢上皮性癌起病比較隱匿，由于缺乏早期診斷方法，70％～80％已屬晚期，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移和擴散，然而即使完善的腫瘤減滅術(shù)之后，病人的復發(fā)轉(zhuǎn)移率仍很高，五年存活率仍徘徊在30%-40%左右。卵巢上皮性癌已成為嚴重威脅婦女生命的惡性腫瘤。
　　PITX2全稱為“垂體同型框2”(pituitary homeobox2),定位于染色體4q25-26，是同

2、型框基因bicoid相關(guān)家族的一員，因最初發(fā)現(xiàn)在垂體發(fā)育中發(fā)揮作用而得名，在脊椎動物的垂體、大腦、心臟、牙齒等發(fā)育過程中起到重要作用。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，PITX2基因突變可能與多種疾病有關(guān)，如：里格爾綜合征(axenfeld-Riegersyndrome)、虹膜發(fā)育不全(iridogoniodysgenesis syndrome)和零星彼得綜合征(sporadic Peter syndrome)等，但是越來越多的資料表明PITX2的異常激

3、活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，例如：大腸癌、前列腺癌、乳腺癌、甲狀腺瘤等。
　　既往大量研究顯示W(wǎng)nt信號通路在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。2002年Kioussi等在垂體腺瘤中研究表明當Wnt信號通路被激活時，Wnt蛋白與細胞表面Fz受體以及共同受體結(jié)合后，從而抑制β-catenin-Axin-APC-GSK-3β復合物的形成，使GSK-3β失活，β-catenin不能被GSK-3β磷酸化而不被降解，逐漸積聚進入細胞核，與轉(zhuǎn)

4、錄因子 TCF/LEF相結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的下游靶基因PITX2，從而促進PITX2下游靶基因如C-myc、Cyclin D1、Cyclin D2等的表達，促進細胞的異常增殖或活化，最終促進腫瘤的發(fā)生。PITX2是Wnt信號通路的下游基因，并受Wnt/Dvl/β-catenin的調(diào)節(jié)，但是在卵巢上皮性癌中PITX2異常激活是否與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)仍不清楚。
　　目的
　　本研究通過從組織水平和細胞水平上對

5、PITX2和β-catenin進行研究，探討PITX2與卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系以及PITX2在卵巢上皮性癌中異常高表達是否受Wnt/β-catenin調(diào)控。
　　材料和方法
　　1．研究對象：
　　1.1臨床標本收集2012年9月-2014年12月在鄭州大學第三附屬醫(yī)院、第一附屬醫(yī)院的手術(shù)標本114例，患者年齡16歲到70歲,中位年齡54歲，根據(jù)組織的良惡程度將標本分為3組：卵巢上皮性癌42例（惡性組)；卵巢

6、上皮性良性腫瘤37例（良性組），正常卵巢組織35例（正常組）；組織標本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋。42例卵巢上皮性癌患者、37例卵巢上皮良性腫瘤、35例非卵巢腫瘤患者血清標本，采血時間均為早上6點到8點，室溫下血液靜置20 min，4℃下3000r／min離心20min，取上清置于EP管，-80℃冰箱保存。所有病例均未合并其他腫瘤病史，術(shù)前、術(shù)后均未接受放、化療，取材前均與患者及家屬溝通并獲得其知情同意，術(shù)后均經(jīng)病理科確診。
　　

7、1.2細胞株 SKOV3、OVCAR3兩株細胞來自于美國ATCC，兩細胞株培養(yǎng)均使用1640培養(yǎng)基（含10%滅火胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素），在37.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞進入對數(shù)期后分別加入Wnt通路抑制劑DKK130 ng/ml。細胞分組：SKOV3空白對照組、SKOV3+DKK1抑制劑組、OVCAR3空白對照組、OVCAR3+DKK1抑制劑組。
　　2．研究方法：a.運用免疫組織化學S

8、P法、實時熒光定量PCR（Q-PCR）方法分別檢測不同卵巢組織中PITX2和β-catenin蛋白和mRNA的表達。b.運用Elisa法檢測不同卵巢疾病患者血清中PITX2蛋白的表達。c.運用MTT法和細胞劃痕實驗檢測SKOV3、OVCAR3兩株細胞在加入Wnt通路抑制劑DKK1前后細胞的增殖能力和遷移能力。d.運用Q-PCR和Western bolt分別檢測SKOV3、OVCAR3兩株細胞在加入Wnt通路抑制劑DKK1前后PITX2和

9、β-catenin蛋白和mRNA的表達。
　　3．統(tǒng)計學方法：采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用卡方檢驗比較正常組、良性組、惡性組中PITX2和β-catenin蛋白的陽性表達率以及兩種蛋白在惡性組中與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。在正常組、良性組、惡性組中PITX2和β-catenin mRNA的表達水平采用單因素方差進行分析，組與組之間兩兩比較采用LSD-t法。應(yīng)用Pearson列聯(lián)系數(shù)進行分析在卵巢上皮性癌組織中PIT

10、X2和β-catenin蛋白表達的相關(guān)性。兩獨立樣本均數(shù)之間比較采用t檢驗。檢驗水準采用α=0.05，組間兩兩比較時檢驗水準采用α′=α/比較次數(shù)=0.0167。
　　結(jié)果
　　1．根據(jù)組織免疫化學染色結(jié)果PITX2蛋白陽性表達位于細胞質(zhì)。PITX2蛋白在正常組中，良性組中以及惡性組中的陽性表達率分別為14.3%（5/35）、16.2%（6/37）、83.3%（35/42），其中惡性組中的陽性表達率明顯高于正常組和良性組（P

11、<0.0167），正常組與良性組相比無明顯差異（P>0.0167)。
　　2．卵巢上皮性癌組織中，PITX2蛋白表達與卵巢上皮性癌的FIGO分期、組織分化程度以及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）；與患者年齡無關(guān)（P>0.05）。
　　3． PITX2蛋白在正常組、良性組、惡性組患者血清中的表達量分別為7.25±2.24ng.mL-1、7.83±1.9ng.mL-1、12.18±2.38ng.mL-1，惡性組患者血清中PIT

12、X2蛋白的表達量明顯高于良性組和正常組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），正常組與良性組之間無明顯差異（P>0.05）。
　　4． PITX2 mRNA在正常組、良性組、惡性組中的相對表達量分別為0.128±0.087、0.167±0.106、0.405±0.126，惡性組中PITX2的mRNA相對表達量明顯高于正常組和良性組（ P<0.001），但正常組與良性組之間無明顯差異（P>0.05）。
　　5．根據(jù)組織免疫化學染

13、色結(jié)果β-catenin蛋白陽性異位表達于細胞質(zhì)。β-catenin蛋白在正常組、良性組、惡性組中的陽性表達率分別為5.7%（2/35）、10.8%（4/37）、85.7%（36/42），惡性組中的陽性表達率明顯高于正常組和良性組（P<0.0167），正常組與良性組相比無明顯差異（P>0.0167)。
　　6．卵巢上皮性癌組織中，β-catenin蛋白的異位表達與卵巢上皮性癌的FIGO分期、組織分化程度以及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<

14、0.05）；與患者年齡無關(guān)（P>0.05）。
　　7．β-catenin mRNA在正常組、良性組、惡性組中的相對表達量分別為0.110±0.082、0.132±0.095、0.286±0.106，惡性組中β-catenin的mRNA相對表達量明顯高于正常組和良性組（P<0.001），但正常組與良性組之間無明顯差異（P>0.05）。
　　8.卵巢上皮性癌組織中，PITX2蛋白表達和β-catenin蛋白的異位表達具有相關(guān)性，

15、并且兩者之間呈正相關(guān)關(guān)系（rp=0.548，P=0.003）。
　　9.細胞實驗中當在SKOV3、OVCAR3細胞株中分別加入Wnt通路抑制劑DKK130ng/ml時，細胞增殖能力和遷移能力均下降（ P<0.05）。
　　10.細胞實驗中當在SKOV3、OVCAR3細胞株中分別加入Wnt通路抑制劑DKK130ng/ml時，PITX2、β-catenin mRNA和蛋白質(zhì)均下降（ P<0.05）。
　　結(jié)論
　　1

16、.PITX2和β-catenin在卵巢上皮性癌中異常高表達，并與卵巢上皮性癌的FIGO分期、組織分化程度以及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且兩者呈正相關(guān)，說明PITX2和β-catenin可能協(xié)同參與了卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展。
　　2.PITX2蛋白在卵巢上皮性癌患者血清中高表達，提示PITX2可能作為卵巢上皮性癌患者早期診斷、評估病情進展的有效指標。
　　3.當Wnt/β-catenin信號通路受到抑制時，PITX2表達量明顯下降