三七中皂苷的抗腫瘤及免疫佐劑活性研究.pdf

1、三七為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根，是著名的傳統(tǒng)中藥，具有止血、散瘀、消腫、止痛等功效?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)研究表明三七中皂苷類成分在免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、物質(zhì)代謝以及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好的活性，是三七的主要生物活性物質(zhì)。本課題測定了從三七中分離得到的8個皂苷人參皂苷Rb1(ginsenosideRb1)、人參皂苷Re(ginsenosideRe)、人參皂苷

2、Rd(ginsenosideRd)、人參皂苷Rg1(ginsenosideRg1)、人參皂苷Rh1(ginsenosideRh1、三七皂苷K(notoginsenosideK)、三七皂苷R1(notoginsenosideR1)和三七皂苷R4(notoginsenosideR4)對體外培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞(HumancervicalcancerHeLacell，HeLa)和人結(jié)直腸癌COLO205細(xì)胞(Humancolorectal

3、carcinomaCOLO205cell，COLO205)的抑制率，并對體外活性最顯著的人參皂苷Rd抑制HeLa細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制進(jìn)行探討。測定三七中11個皂苷化合物的溶血性，觀察這些皂苷對OVA受免小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答的影響，探討了溶血性、佐劑活性與化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的構(gòu)效關(guān)系。MTT法測定Rd體外對刺激原誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響，RT-PCR方法分析Rd對小鼠脾細(xì)胞IL-2、IL-4、IL-10以及INF-γ基因表

4、達(dá)的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測以Rd為佐劑的OVA受免小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-5、INF-γ和TNF-α等細(xì)胞因子的水平，以及血液中T淋巴細(xì)胞亞群CD4+和CD8+細(xì)胞比例，初步研究了Rd的免疫佐劑活性作用機(jī)理。 1.三七中人參皂苷Rd對HeLa細(xì)胞增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用 MTT法分析結(jié)果表明：Rb1、Re、Rg1、Rh1、Rd、K、R1和R4對體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞和COLO205細(xì)胞增殖均有一定程度的抑制作用，

5、其中以Rd的活性最顯著。Rd對HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用呈良好的劑量和時間依賴性，作用48小時的IC50值為150.5±0.80μg/ml?？捡R斯亮藍(lán)法測定經(jīng)不同濃度Rd處理48小時HeLa細(xì)胞中總蛋白含量的結(jié)果顯示Rd可顯著降低HeLa細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量，并呈濃度依賴性。 Rd180μg/ml處理48小時的HeLa細(xì)胞，姬姆薩染色后在光學(xué)顯微鏡下可觀察到細(xì)胞染色質(zhì)濃縮并靠近核膜，產(chǎn)生核邊集、核膜裂解現(xiàn)象；吖啶橙染色后在熒光顯微鏡

6、下觀察，細(xì)胞皺縮、核濃染甚至可見濃染的碎片；電鏡下觀察處理細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡超微結(jié)構(gòu)變化，表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，表面微絨毛減少或消失，胞漿濃縮，胞漿內(nèi)空泡增多，細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生邊集固縮，在核膜周邊聚集形成高電子密度的質(zhì)塊，并出現(xiàn)凋亡小體。180μg/ml和210μg/mlRd作用48小時，可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞DNA降解，在瓊脂糖凝膠電泳譜上呈特征性“梯狀”條帶。 流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞經(jīng)不同濃度Rd作用48小時后，隨Rd

7、濃度的升高，G0/G1期細(xì)胞顯著減少，S期細(xì)胞顯著增加，而G2/M期無顯著性變化。Rd120、180和210μg/ml處理48小時HeLa細(xì)胞的凋亡率分別為7.36％、15.89％和35.82％，而對照細(xì)胞僅出現(xiàn)0.94％的凋亡峰。 免疫組化法分析顯示HeLa細(xì)胞經(jīng)不同濃度Rd作用48小時，其bcl-2表達(dá)陽性率細(xì)胞顯著減少，而bax表達(dá)陽性率細(xì)胞顯著增加，bcl-2和bax比值顯著降低；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示Rd能顯著降低He

8、La細(xì)胞的線粒體相對跨膜電位(△ψm)，并呈濃度依賴性關(guān)系。MTT法測定顯示caspase-3抑制劑DEVD-CHO可顯著提高60、90、120、180、240μg/mlRd處理48小時HeLa細(xì)胞的存活率。 Rd對HeLa細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，并可通過下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)bax蛋白表達(dá)，降低線粒體跨膜電位，活化caspase-3，誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。 2.三七中皂苷免疫佐劑活性的構(gòu)效關(guān)系研究 溶血

9、性試驗結(jié)果顯示，三七中11個皂苷的HD50值均大于300μg/ml。4個原人參二醇型皂苷的溶血活性：K＞R4＞Rb1＞Rd。7個原人參三醇型皂苷中，Rh1的溶血性顯著或極顯著高于其余6個皂苷(P＜0.01)；Rh4和U的HD50顯著低于R2、Rg1和Re(P＜0.05或P＜0.01)；Rh4、U和R1三者之間的溶血性無顯著差異(P＞0.05)，而R2的HD50值則顯著低于Re(P＜0.05)。 Rh4、Rg1和R1(分別含1個、

10、2個和3個糖基)的量效曲線顯示3個皂苷25μg均能顯著提高OVA受免小鼠血清中IgG總抗體及IgG1、IgG2b抗體亞類的滴度(P＜0.05或P＜0.01)，且作用均優(yōu)于10μg和50μg劑量。 淋巴細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示11個皂苷均能顯著增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的OVA受免小鼠T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(P＜0.01)，4個原人參二醇型皂苷的活性：Rd＞Rb1＞K＞R4(P＜0.01)，而7個原人參三醇型皂苷中，Rg1的作用高于除Rh4以外5個

11、皂苷，Rh4和Rh1之間無顯著差異，而Rh1、R1、R2、Re和U5個皂苷之間均有顯著差異。除R4外，其余10個皂苷也均能顯著促進(jìn)LPS或OVA誘導(dǎo)OVA受免小鼠B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(P＜0.01)，其活性強(qiáng)弱排序與對ConA誘導(dǎo)小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖作用一致。 11個皂苷免疫組小鼠血清中OVA特異性IgG和IgG1抗體水平顯著或極顯著高于單獨(dú)OVA對照組(P＜0.01)；4個原人參二醇型皂苷免疫小鼠血清中，IgG抗體滴度：Rd＞K

12、＞Rb1＞R4，IgG1抗體滴度：Rd＞Rb1＞R4＞K；7個原人參三醇型皂苷免疫小鼠血清中，IgG和IgG1抗體水平：Re＞Rg1＞Rh4，R1＞Rh1＞R2＞U。11個皂苷也均能極顯著提高OVA受免小鼠血清中IgG2b和IgG2a抗體滴度(P＜0.01)；4個原人參二醇型皂苷的作用：Rd＞Rb1＞K＞R4，而7個原人參三醇型皂苷的活性：Rg1＞Rh4＞R1＞Re＞Rh1＞R2＞U。 11個皂苷的溶血活性和免疫佐劑活性與化學(xué)結(jié)

13、構(gòu)之間的構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果表明苷元的類型、糖鏈的長度、組成糖鏈糖基的種類、數(shù)目及連接方式均對此類皂苷的溶血性和免疫佐劑活性有顯著的影響。這些皂苷構(gòu)效關(guān)系的闡明為設(shè)計合成更理想的四環(huán)三萜皂苷類佐劑提供了科學(xué)依據(jù)。 3.三七中人參皂苷Rd免疫佐劑活性作用機(jī)理研究 Rd在濃度0.01～100μg/ml范圍內(nèi)體外能顯著或極顯著促進(jìn)對ConA誘導(dǎo)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和LPS誘導(dǎo)小鼠B淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)(P＜0.05或P＜0.01)

14、，其量效曲線均呈“鐘罩”型。mRNA半定量測定結(jié)果顯示Rd能顯著促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞IL-2、INF-γ、IL-4以及IL-10的基因表達(dá)(P＜0.01)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明：Rd能誘導(dǎo)OVA受免小鼠分泌Th1細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2以及Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5(P＜0.05和P＜0.01)；Rd也能提高OVA受免小鼠血液中CD4+淋巴細(xì)胞亞群數(shù)，但與OVA對照組相比，無顯著性差異(P＞0.05)。