阻斷間接識別途徑抑制同種異體移植慢性排異的實驗研究.pdf

1、目的： 1．建立體外培養(yǎng)、擴(kuò)增受體C3H小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞(BM-DC)的方法，并對其進(jìn)行鑒定；觀察其對供體C57BL/6小鼠可溶性抗原提呈的有效性。同時探討B(tài)7反義肽(B7 antiserlse peptide，B7AP)抑制單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的作用，并明確B7AP顯著抑制單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的最適工作濃度。 2．通過體外供體抗原間接識別反應(yīng)體系，觀察B7AP預(yù)處理的負(fù)載供體抗原的受體樹突狀細(xì)胞(dendriti

2、c cell，DC)誘導(dǎo)針對供體抗原的特異性免疫低反應(yīng)；同時通過體內(nèi)實驗進(jìn)一步觀察其可行性，并對其機(jī)制進(jìn)行初步分析。 3．建立同種異基因小鼠頸總動脈原位移植模型(C57BL/6→C3H)，觀察阻斷間接識別途徑對移植動脈慢性排異的影響，并初步探討此種效應(yīng)的局部機(jī)制。 方法： 1．體外分離受體C3H小鼠骨髓細(xì)胞，在重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF) 和腫瘤壞死因子-α(rmTNF-α)的刺激下，

3、手法篩選、培養(yǎng)擴(kuò)增受體小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞；通過細(xì)胞形態(tài)、功能、表面分子表達(dá)對其進(jìn)行鑒定。在培養(yǎng)過程中加入制備的供體C57BL/6小鼠可溶性抗原，通過與受體C3H小鼠脾臟T細(xì)胞進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，觀察受體DC負(fù)載供體抗原的有效性。進(jìn)一步利用不同濃度的B7AP與負(fù)載供體抗原的受體DC進(jìn)行充分孵育，并與受體脾臟T細(xì)胞進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)，建立B7AP濃度對數(shù)值與單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)cpm值(每分鐘液閃數(shù))的曲線，應(yīng)用統(tǒng)

4、計學(xué)方法尋找B7AP顯著抑制單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的最適工作濃度。 2．建立體外供體抗原間接識別反應(yīng)體系，利用B7AP預(yù)處理的負(fù)載供體抗原的受體DC與受體T細(xì)胞行初次單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，收集反應(yīng)后受體T細(xì)胞，與負(fù)載供體抗原、第三供體抗原的受體DC和供體DC行再次單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，觀察反應(yīng)后受體T細(xì)胞針對間接途徑提呈的供體抗原、第三供體抗原以及直接途徑提呈的供體抗原的免疫活性。同時通過B7AP封閉的負(fù)載供體抗原的受體DC對受體

5、小鼠進(jìn)行預(yù)處理后，分離受體脾臟T細(xì)胞與負(fù)載供體抗原、第三供體抗原的受體DC和供體DC行再次單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，了解B7AP封閉的負(fù)載供體抗原的受體DC體內(nèi)有效性，并分別在早期和2月時對受體小鼠進(jìn)行供體抗原刺激后取脾臟進(jìn)行細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞凋亡(apoptosis)分析，初步探討免疫耐受的其他可能機(jī)制。 3．建立小鼠同種異基因頸總動脈原位移植模型(C57BL/6→C3H)，通過術(shù)前3 天對受體小鼠進(jìn)行股靜脈注射B7AP預(yù)處理的負(fù)

6、載供體抗原的受體DC，2月后取移植動脈進(jìn)行病理分析，觀察移植動脈內(nèi)膜增生情況，作計算機(jī)圖像分析，并通過對移植動脈的免疫組化分析，初步了解此效應(yīng)的局部機(jī)制。 結(jié)論： 1.C3H小鼠骨髓前體細(xì)胞在rmGM-CSF 和TNF-α的刺激下，可以擴(kuò)增培養(yǎng)大量成熟 DC。 2.受體C3H小鼠的成熟DC能夠有效的提呈供體C57BL/6小鼠可溶性抗原。 3.負(fù)載供體抗原的受體C3H小鼠DC經(jīng)B7AP預(yù)處理后能夠抑制其和受

7、體小鼠T 細(xì)胞的單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。 4.B7AP預(yù)處理的負(fù)載供體抗原的受體DC能夠誘導(dǎo)針對供體抗原的特異性免疫低反應(yīng)，同時可能通過誘導(dǎo)Th1→Th2免疫偏移來加強這種效應(yīng)。 5.斷間接途徑產(chǎn)生的受體T細(xì)胞的特異性免疫低反應(yīng)不影響其對直接途徑提呈的供體抗原的免疫反應(yīng)。 6. B7AP預(yù)處理的負(fù)載供體抗原的受體DC能夠有效抑制小鼠同種異基因頸總動脈原位移植(C57BL/6→C3H)后移植動脈的內(nèi)膜增生，TGF-β