惡性神經(jīng)上皮性腫瘤的血管生成擬態(tài)及其對(duì)患者預(yù)后的影響分析.pdf

1、神經(jīng)上皮性腫瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤，總體上占顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率的一半以上。按照2007年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)，神經(jīng)上皮性腫瘤包括星形細(xì)胞腫瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤、混合型膠質(zhì)瘤、室管膜腫瘤、脈絡(luò)叢腫瘤、起源不明的神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤、神經(jīng)元及混合性神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤、成神經(jīng)細(xì)胞腫瘤、松果體實(shí)質(zhì)腫瘤和胚胎性腫瘤十大類(lèi)。這些腫瘤基本的治療原則是在多數(shù)情況下應(yīng)當(dāng)采取最大限度的手術(shù)切除，術(shù)后

2、輔以放射治療和化療等綜合治療。本課題以其中兩種惡性程度最高的神經(jīng)上皮腫瘤—膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和髓母細(xì)胞瘤作為研究的目標(biāo)。
　　 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有發(fā)病率高、手術(shù)難以達(dá)到全部切除且術(shù)后復(fù)發(fā)率高、中位生存時(shí)間短、死亡率高和治愈率低等特點(diǎn)。雖然近幾十年來(lái)對(duì)惡性腫瘤的診斷和治療總體上取得了顯著進(jìn)步，但是，由于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)迅速、廣泛侵襲、細(xì)胞構(gòu)成具有高度的異質(zhì)性，迄今為止，對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的治療收效甚微，患者預(yù)后仍然非常差?；颊叩闹形簧鏁r(shí)

3、間僅有12-15月，多數(shù)患者兩年內(nèi)死亡，僅有不足5％患者可活至5年。與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相比較，髓母細(xì)胞瘤患者經(jīng)綜合治療后，部分患者可以獲得較長(zhǎng)的術(shù)后生存期，但是，術(shù)后也伴隨著重要神經(jīng)功能缺損而導(dǎo)致生存質(zhì)量較差。如何研發(fā)安全有效同時(shí)副作用少的治療方法，在延長(zhǎng)惡性腫瘤患者生存時(shí)間的同時(shí)改善生存質(zhì)量，這是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。
　　 Folkman早在1971年就提出腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于血管生成的理論(angiogenesis)。腫瘤周?chē)难?/p>

4、管以“出芽”的方式形成新生的血管進(jìn)入腫瘤，進(jìn)而形成較原始的血管網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)重構(gòu)作用，形成腫瘤血管的微循環(huán)(angiogenesis)。內(nèi)皮細(xì)胞在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。Folkman等認(rèn)為，既然腫瘤的生長(zhǎng)依賴(lài)于內(nèi)皮細(xì)胞主導(dǎo)的血管生成，而腫瘤血管內(nèi)壁由內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，那么通過(guò)藥物特異性的殺傷腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，切斷腫瘤的供血血管，阻斷腫瘤生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而“殺死”腫瘤細(xì)胞，以達(dá)到治療腫瘤的目的?；谶@樣的假設(shè)，研究人員研發(fā)了針對(duì)腫瘤

5、血管內(nèi)皮細(xì)胞抗腫瘤藥物，如貝伐單抗(bevacizumab)等。臨床使用這些藥物在一定程度上可以限制原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)，但是，長(zhǎng)期收效甚微，對(duì)病人的遠(yuǎn)期生存率幾乎沒(méi)有影響，其結(jié)果令人費(fèi)解。直到Maniotis發(fā)現(xiàn)血管生成擬態(tài)現(xiàn)象，為這個(gè)問(wèn)題提供了一個(gè)合理的解釋。
　　 Maniotis等人于1999年首次提出了血管生成擬態(tài)的概念。在對(duì)黑色素瘤血管形態(tài)學(xué)進(jìn)行深入細(xì)致的研究后發(fā)現(xiàn)，高度惡性的黑色素瘤細(xì)胞在基因水平上失分化，表達(dá)上皮細(xì)胞、內(nèi)

6、皮細(xì)胞和干細(xì)胞等多種類(lèi)型細(xì)胞的表型，能夠形成類(lèi)似于血管的管道結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)在在功能上與真正的血管類(lèi)似，即能夠運(yùn)輸腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)成分。但是在形態(tài)上又有別于血管，表現(xiàn)為血管生成擬態(tài)管道的內(nèi)壁上襯覆的是腫瘤細(xì)胞而不是內(nèi)皮細(xì)胞。血管生成擬態(tài)使腫瘤細(xì)胞和血液直接接觸，部分腫瘤細(xì)胞可以直接進(jìn)入血液循環(huán)，這導(dǎo)致惡性腫瘤在發(fā)病的極早期就發(fā)生轉(zhuǎn)移?？鼓[瘤血管生成的藥物雖然可以特異性的破壞腫瘤血管，但是這些藥物對(duì)存在血管生成擬態(tài)的惡性腫瘤作用不大

7、。因?yàn)?，血管生成擬態(tài)的管道內(nèi)壁上襯覆的是惡性腫瘤細(xì)胞，而不是內(nèi)皮細(xì)胞，惡性腫瘤可以通過(guò)血管生成擬態(tài)獲得快速增殖所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)。還有研究表明，阻斷腫瘤血管切斷腫瘤細(xì)胞血液供應(yīng)的同時(shí)，導(dǎo)致局部微環(huán)境的缺氧狀態(tài)，缺氧狀態(tài)不但無(wú)法殺傷腫瘤細(xì)胞，反而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞促進(jìn)血管生成的基因如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1抗體(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor1，VEGFR1)上調(diào)，VEGFR1同時(shí)可以促進(jìn)

8、血管生成擬態(tài)和血管生成。
　　 2004年Maniots和Folberg綜合對(duì)各種惡性腫瘤血管生成擬態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，提出了兩種不同類(lèi)型的血管生成擬態(tài)，即管道型血管生成擬態(tài)(tubular typevasculogenic mimicry)和圖案樣基質(zhì)型血管生成擬態(tài)(patterned matrix typevasculogenic mimicry)。管道型血管生成擬態(tài)在形態(tài)上與內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的腫瘤血管易相混淆，但襯覆于管道內(nèi)壁的是腫

9、瘤細(xì)胞，而不是內(nèi)皮細(xì)胞，各種檢測(cè)手段都未發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞及其標(biāo)記物;圖案樣基質(zhì)型血管生成擬態(tài)其形態(tài)與內(nèi)皮血管相差極遠(yuǎn)，由富含基質(zhì)蛋白如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和Ⅳ、Ⅵ型膠原的細(xì)胞外基質(zhì)鞘形成的中空的、能夠運(yùn)輸液體的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，包繞著多少不等的細(xì)胞群，這些結(jié)構(gòu)與內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的血管相連通，形成一個(gè)傳輸液體的網(wǎng)絡(luò)。血管生成擬態(tài)的提出是基于對(duì)黑色素瘤的研究，緊隨其后的對(duì)其他非黑色素瘤的研究，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、骨肉瘤等

10、惡性腫瘤，也證實(shí)了血管生成擬態(tài)的存在。在對(duì)不同類(lèi)型腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，存在血管生成擬態(tài)的腫瘤細(xì)胞有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而且其臨床預(yù)后較差。
　　 已有研究證實(shí)血管生成擬態(tài)存在于高級(jí)別的膠質(zhì)瘤中。2005年，Yue等對(duì)45例不同級(jí)別的星形細(xì)胞瘤進(jìn)行免疫組織化學(xué)觀察，在2例中證實(shí)了圖案樣基質(zhì)型血管生成擬態(tài)。用CD34-過(guò)碘酸希夫染色(CD34-Periodic Acid-Schiffstaining，CD34-PAS)雙染色法進(jìn)行處

11、理，發(fā)現(xiàn)部分膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本中存在PAS陽(yáng)性CD34陰性的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)相互連結(jié)形成半閉合或完全閉合的環(huán)，包繞著數(shù)量不一的腫瘤細(xì)胞團(tuán)。這些環(huán)是實(shí)心的或是中空的。中空的環(huán)狀結(jié)構(gòu)里面發(fā)現(xiàn)有紅細(xì)胞和血漿的痕跡。這些現(xiàn)象與Folberg描述的圖案樣基質(zhì)型一致。管道型血管生成擬態(tài)的存在直到最近才有研究證實(shí)。2010年E1 Hallani等使用CD34-PAS染色法對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤微血管進(jìn)行觀察時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種與CD34陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞血管不同的管道。這

12、種管道里面有紅細(xì)胞存在，但是其內(nèi)壁上襯覆的是CD34陰性的細(xì)胞。為了確定這種管道的性質(zhì)，研究者對(duì)病理標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片免疫組織化學(xué)染色觀察，發(fā)現(xiàn)了CD34陽(yáng)性細(xì)胞和CD34陰性細(xì)胞的管道相連接的區(qū)域。從而證實(shí)了這種管道實(shí)質(zhì)上是血管的延續(xù)。為了進(jìn)一步研究CD34陰性染色的細(xì)胞的性質(zhì)。研究者應(yīng)用熒光原位雜交方法檢測(cè)CD34陰性細(xì)胞的表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)基因的擴(kuò)增(EGF

13、R基因的擴(kuò)增是原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中最常見(jiàn)的基因改變之一)，證實(shí)了這種細(xì)胞就是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，即膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在由腫瘤細(xì)胞襯覆的與內(nèi)皮細(xì)胞血管相連接的管道，這就是管道型血管生成擬態(tài)。
　　 有研究報(bào)導(dǎo)血管生成擬態(tài)是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立不良因素之一。該研究以各種級(jí)別的星形細(xì)胞腫瘤為研究總體，其中包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。但是，該研究在分析血管生成擬態(tài)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的關(guān)系時(shí)指出，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中是否存在血管生成擬態(tài)對(duì)患者的預(yù)后沒(méi)有影響。

14、該研究中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的樣本量小，其結(jié)論需要進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，對(duì)于小兒中最常見(jiàn)的腦部惡性腫瘤—髓母細(xì)胞瘤的血管生成擬態(tài)現(xiàn)象，至今尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。
　　 基于以上的研究背景，本課題分別研究髓母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的血管生成擬態(tài)及其對(duì)患者預(yù)后的影響。本研究應(yīng)用CD34-PAS染色法分別對(duì)髓母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病理標(biāo)本的血管生成擬態(tài)進(jìn)行研究，收集整理患者的資料，利用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型篩選影響預(yù)后的獨(dú)立影響因素，最后利用Kaplan

15、-Meier法繪制生存曲線及l(fā)og-rank檢驗(yàn)對(duì)變量進(jìn)行分析。
　　 第一章髓母細(xì)胞瘤的血管生成擬態(tài)的存在及其預(yù)后意義
　　 目的:驗(yàn)證髓母細(xì)胞瘤中是否存在血管生成擬態(tài)并且進(jìn)一步分析血管生成擬態(tài)對(duì)髓母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后意義。
　　 方法:收集南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院病理科自1999年至2009年的髓母細(xì)胞瘤標(biāo)本共62例。納入標(biāo)準(zhǔn):1、患者在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院腦外科行手術(shù)治療，手術(shù)前未經(jīng)放療和化療;2、術(shù)后病理確診為

16、髓母細(xì)胞瘤;3、病人術(shù)后均經(jīng)放療和化療;4、可以獲得完整的病人信息包括術(shù)前、住院期間、后續(xù)的放化療、隨訪結(jié)束時(shí)所有患者的生存情況。排除標(biāo)準(zhǔn):1、術(shù)后放棄放療和化療;2、行診斷性活檢和/或腦室腹腔分流術(shù)的患者;3、修正診斷的患者。最后，得到符合納入標(biāo)準(zhǔn)的病例共41例。整理病人的臨床資料包括年齡、性別、卡氏評(píng)分(Karnofsky Performance Scale，KPS)、是否存在腦水腫、腫瘤的病理分型、腫瘤體積、腫瘤的位置、是否發(fā)生遠(yuǎn)

17、處轉(zhuǎn)移和隨訪觀察患者術(shù)后生存和死亡狀態(tài)，計(jì)算生存時(shí)間。將所有的病理切片進(jìn)行CD34-PAS染色，根據(jù)結(jié)果將患者分為兩組，分別是血管生成擬態(tài)陽(yáng)性組和血管生成擬態(tài)陰性組，對(duì)兩組進(jìn)行微血管密度計(jì)數(shù)。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix Metallopreteinases，MMP-2)、MMP-14、酪氨酸蛋白激酶受體A2(Ephrin

18、type-A receptor2，EphA2)和層粘連蛋白(laminin)5γ2免疫組化染色，計(jì)算免疫指數(shù)，評(píng)估這些蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)意義。兩組之間的VEGF、laminin5γ2、EphA2、MMP-2、MMP-14表達(dá)差異用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)比較;兩組之間的微血管密度差異用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較;血管生成擬態(tài)陽(yáng)性和血管生成擬態(tài)陰性兩組病人的臨床病理特點(diǎn)包括年

19、齡、性別、KPS評(píng)分、是否有腦水腫、腫瘤的病理分型、腫瘤體積、腫瘤的位置、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間是否有差異應(yīng)用x2檢驗(yàn)進(jìn)行分析;使用Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單變量和多變量分析，篩選對(duì)預(yù)后有影響的獨(dú)立變量;用Kaplan-Meier生存分析法和log-rank檢驗(yàn)比較各組變量生存時(shí)間的差異，并繪制生存曲線圖;觀察期結(jié)束時(shí)仍然存活的患者和失訪的患者被視為刪失數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果:本研究共納入41例髓母細(xì)胞瘤病例，其中9(22％)例腫瘤

20、中存在血管生成擬態(tài)。具有血管生成擬態(tài)的髓母細(xì)胞瘤其微血管密度較少（P=0.000），間接證明血管生成擬態(tài)具有輸送血液的功能。免疫組織化學(xué)染色評(píng)估免疫指數(shù)提示存在血管生成擬態(tài)的髓母細(xì)胞瘤中MMP-2（P=0.001）、MMP-14（P=0.039）EphA2(P=0.036)和laminin5γ2（P=0.005）的表達(dá)上調(diào)。Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗(yàn)提示具有血管生成擬態(tài)的腫瘤患者的術(shù)后生存時(shí)間較短（P=0.0

21、00）。應(yīng)用Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型的單變量法和多變量法篩選變量，單變量法分析結(jié)果提示腫瘤存在血管生成擬態(tài)（P=0.001）、病人的術(shù)前KPS評(píng)分較低（P=0.010）和術(shù)前腫瘤已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移（P=0.044）對(duì)病人的預(yù)后有影響作用，多變量分析結(jié)果提示血管生成擬態(tài)（P=0.000）和髓母細(xì)胞瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.019）是影響病人預(yù)后的獨(dú)立影響因素。
　　 結(jié)論:本研究驗(yàn)證了血管生成擬態(tài)存在于髓母細(xì)胞瘤中;提示腫瘤中存在血管生成擬態(tài)

22、的患者預(yù)后較差，血管生成擬態(tài)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。
　　 第二章膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的血管生成擬態(tài)及其預(yù)后意義
　　 目的:評(píng)價(jià)血管生成擬態(tài)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的術(shù)后生存期的影響。
　　 方法:收集自2002至2009年在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)治療，術(shù)后病理診斷為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本共112例。納入標(biāo)準(zhǔn):1、患者在珠江醫(yī)院腦外科行手術(shù)治療，在手術(shù)前未經(jīng)放療和化療;2、術(shù)后病理確診為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;3、可以獲得

23、完整的病人信息包括術(shù)前、住院期間、后續(xù)的放化療、隨訪結(jié)束時(shí)所有患者的生存情況。4、病人術(shù)后均經(jīng)放療和化療。排除標(biāo)準(zhǔn):1、術(shù)后放棄放療和化療;2、行診斷性活檢;3、由低級(jí)別膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)變而來(lái);4、修正診斷為具有少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤成分的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastomas with anoligodendroglioma component，GBMO)的病例。經(jīng)排除后得到符合納入標(biāo)準(zhǔn)的病例共86例?；仡櫡治稣聿∪说呐R床資料包括年齡、性別、KP

24、S評(píng)分、是否有水腫、腫瘤體積、腫瘤的切除范圍和術(shù)后患者的生存和死亡時(shí)間。將所有的病理切片進(jìn)行CD34-PAS染色，根據(jù)結(jié)果將患者分為血管生成擬態(tài)陽(yáng)性組和血管生成擬態(tài)陰性組。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，P＜0.05被認(rèn)為是差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;觀察期結(jié)束時(shí)仍然存活的患者和失訪的患者被視為刪失數(shù)據(jù)。兩組之間的微血管密度差異用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)法;血管生成擬態(tài)陽(yáng)性和陰性兩組病人的臨床病理特點(diǎn)包括年齡、性別、KPS評(píng)分、是否有水腫、

25、病理分型、腫瘤體積、腫瘤是否復(fù)發(fā)、腫瘤的切除范圍（包括腫瘤全切或腫瘤部分切除）的差異采用Pearsonx2檢驗(yàn);使用Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分別進(jìn)行單變量分析和多變量分析，篩選對(duì)預(yù)后有影響的獨(dú)立變量;用Kaplan-Meier生存分析法的log-rank檢驗(yàn)比較獨(dú)立變量的各組的生存時(shí)間，并繪制生存曲線圖。
　　 結(jié)果:本研究共納入86例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤者，其中23例存在血管生成擬態(tài)。血管生成擬態(tài)陽(yáng)性和陰性兩組病人的性別(P=0.587

26、)，年齡(P=0.445)，KPS評(píng)分（P=0.681），腦水腫(P=0.908)，原發(fā)腫瘤體積(P=0.223)，微血管密度(P=0.808)，腫瘤復(fù)發(fā)（P=0.138），或腫瘤切除的范圍(P=0.241)的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組之間微血管密度比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)。單變量分析提示血管生成擬態(tài)(P=0.018)、年齡（P=0.000）、KPS評(píng)分(P=0.006)和腫瘤體積（P=0.047）是影響患者術(shù)后生存時(shí)

27、間的變量;多變量分析提示血管生成擬態(tài)（P=0.003）、年齡（年齡＞65歲）(P=0.004)、KPS評(píng)分(KPS≤60分)(P=0.019)和原發(fā)腫瘤體積（P=0.002）是影響患者術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立影響因素。Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗(yàn)提示血管生成擬態(tài)陽(yáng)性組的患者中位生存時(shí)間是11.17月，血管生成擬態(tài)陰性組是16.10月，兩者相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)。
　　 結(jié)論:本回顧性研究