鼻息肉組織Th細胞亞群、嗜酸性粒細胞浸潤及相關轉錄因子表達.pdf

1、第一部分：鼻息肉組織Th細胞亞群的流式細胞術測定 背景 鼻息肉是臨床常見病，手術后極易復發(fā)，尚無根治性手段。尚無確定的臨床病理分型和圍手術期綜合治療原則。鼻息肉的發(fā)生機制也不確定，關于鼻息肉的發(fā)生機制，主要存在兩種學說之爭，即金黃色葡萄球菌超抗原學說和真菌變態(tài)反應學說。細菌、病毒、真菌及變應原等可能作為最初的觸發(fā)因素引起鼻腔外側壁的炎癥而發(fā)展形成鼻息肉。鼻息肉組織含大量炎癥細胞如嗜酸性粒細胞和淋巴細胞，這些細胞可能在鼻息肉發(fā)

2、病中起重要作用。 T 淋巴細胞按表面分子不同分為CD4+T淋巴細胞(又稱輔助T淋巴細胞，Thelp cell，Th細胞)和CD8+T淋巴細胞(又稱細胞毒性T細胞，CTL，或殺傷性T細胞，TC)。Th細胞按產(chǎn)生細胞因子和功能的不同又分為Th1細胞和Th2細胞。功能不同的輔助T淋巴細胞(Th1細胞、Th2細胞)存在的證據(jù)對基礎和臨床免疫學產(chǎn)生了重大影響。Th1和Th2細胞在免疫應答的平衡中起關鍵性作用。Th1細胞主要產(chǎn)生干擾素-γ

3、(IFN-γ)，促進細胞免疫，增強吞噬細胞的抗感染機制；Th2細胞主要產(chǎn)生白介素-4(IL-4)，促進體液免疫，在變態(tài)反應中起作用。這些基礎免疫學發(fā)現(xiàn)結合鼻息肉的發(fā)生機制，可以推測在鼻息肉組織中，Th1細胞可能與金葡菌感染引起的免疫應答有關，Th2細胞可能與真菌及變應原引起的變態(tài)反應有關。 關于鼻息肉組織T細胞亞群及細胞因子的研究已有報道，但對Th細胞亞群的深入研究尚少，尚無關于合并與不合并AR的鼻息肉在Th細胞亞群方面的研究報

4、道。 本實驗以流式細胞術測定合并與不合并AR的鼻息肉組織的Th1和Th2細胞百分率，以明確不同類型鼻息肉組織在Th細胞亞群和免疫應答類型方面的差異，評價金葡菌感染和真菌變態(tài)反應因素在不同類型鼻息肉病因?qū)W中的作用，評價金黃色葡萄球菌超抗原學說和真菌變態(tài)反應學說對不同類型鼻息肉發(fā)生形成的意義，指導鼻息肉分型和綜合治療。 方法 32例鼻息肉病例分為兩組，其中包括不合并變應性鼻炎(AR)的鼻息肉組16例，合并變應性鼻炎

5、的鼻息肉組16例，依據(jù)變應性鼻炎病史和臨床表現(xiàn)，以及變應原點刺試驗區(qū)分不合并AR的鼻息肉與合并AR的鼻息肉。新鮮手術標本制備單細胞懸液，流式細胞儀測定Th1和Th2細胞百分率，在CD4+細胞中，細胞內(nèi)產(chǎn)生IFN-γ的為Th1細胞，產(chǎn)生IL-4的為Th2細胞，同時產(chǎn)生IFN-γ和IL-4的為Th0細胞。測得的Th細胞百分率用x±s表示，用SPSS for WindowsVer.11.5 軟件進行統(tǒng)計分析，對兩鼻息肉組的Th1、Th2細胞百

6、分率進行正態(tài)性檢驗和獨立樣本t檢驗。 結果 息肉組織含有大量Th細胞并且以Th1細胞為主；不合并AR的鼻息肉組Th1和Th2細胞平均百分率分別為46.28％±14.95％和0.63％±0.31％；合并AR的鼻息肉組Th1和Th2細胞平均百分率分別為38.25％±9.16％和7.34％±2.54％；統(tǒng)計學分析顯示不合并AR的鼻息肉組與合并AR的鼻息肉組相比Th1細胞平均百分率無顯著差異，t=1.83，P>0.05；合并

7、AR的鼻息肉組Th2細胞平均百分率顯著高于不合并AR的鼻息肉組，t=10.48，P<0.01。 結論鼻息肉組織以Th1細胞亞群為主；合并AR的鼻息肉Th2細胞數(shù)顯著高于不合并AR的鼻息肉，合并與不合并AR的鼻息肉在Th細胞亞群和免疫應答類型方面存在差異；金葡菌感染可能在不合并AR的鼻息肉的發(fā)生形成中起關鍵作用，金葡菌感染和真菌變態(tài)反應因素可能在合并AR的鼻息肉的發(fā)生形成中均有一定作用。 第二部分：鼻息肉組織嗜酸性粒細胞浸

8、潤與Th2細胞的關系 背景 鼻息肉組織含大量炎癥細胞如嗜酸性粒細胞和淋巴細胞，這些細胞可能在鼻息肉的發(fā)生和形成中起重要作用。在過去的二十年中，對嗜酸性粒細胞在某些病理生理過程中的作用有了逐步認識。嗜酸性粒細胞的前體細胞從骨髓釋放進入血液循環(huán)，在化學趨化性因子的作用下進入作用部位，嗜酸性粒細胞的發(fā)育和成熟可發(fā)生在外周炎癥部位?；罨人嵝粤＜毎谙⒓纳x病、肉芽腫病變、纖維化、許多惡性腫瘤及鼻腔鼻竇疾病中起作用。在變應性

9、鼻炎(AR)，嗜酸性粒細胞從外周血浸潤到鼻腔粘膜組織后主要參與遲發(fā)相反應，Th-2細胞分泌的細胞因子可促使嗜酸性粒細胞的集聚和活化。在Th-2類細胞因子中，IL-4起中心性作用，它可促使IgE的合成，通過上調(diào)粘附分子的表達引起嗜酸性粒細胞集聚，增加粘液的生成。嗜酸性粒細胞的顆粒中含有許多細胞毒性蛋白包括嗜酸性細胞陽離子蛋白(ECP)，主要堿性蛋白(MBP)，嗜酸性粒細胞過氧化物酶(EPO)和嗜酸性細胞來源神經(jīng)毒素。嗜酸性粒細胞的細胞毒性

10、作用可能在針對變應原和對抗真菌的免疫反應中起關鍵性作用。 關于鼻息肉組織嗜酸性粒細胞浸潤的研究已有報道，但對合并與不合并AR的鼻息肉組織嗜酸性粒細胞浸潤程度差異的研究尚少，尚無鼻息肉組織嗜酸性粒細胞浸潤與Th2細胞關系的研究報道。本實驗對合并與不合并AR的鼻息肉組織石蠟標本HE切片進行嗜酸性粒細胞計數(shù)，并分析嗜酸性粒細胞數(shù)與與Th2細胞百分率的相關性，以明確合并與不合并AR的鼻息肉組織在嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)量上的差別，明確嗜酸性粒

11、細胞浸潤與Th2細胞的關系，探討鼻息肉組織嗜酸性粒細胞浸潤的發(fā)生機制。 方法 對兩組鼻息肉病例常規(guī)病理標本HE切片進行嗜酸性粒細胞浸潤程度的定量，計數(shù)每高倍視野平均嗜酸性粒細胞數(shù)。嗜酸性粒細胞數(shù)用均數(shù)±標準差表示。使用SPSS for Windows Ver.11.5軟件對兩鼻息肉組的嗜酸性粒細胞數(shù)進行正態(tài)性檢驗和獨立樣本t檢驗，并對全部病例的Th2細胞百分率與嗜酸性粒細胞數(shù)進行相關性分析。 結論 合并A

12、R的鼻息肉組織嗜酸性粒細胞數(shù)顯著高于不合并AR的鼻息肉組織；鼻息肉組織的Th2細胞與嗜酸性粒細胞數(shù)相關，Th2細胞可能通過釋放Th2細胞因子促使鼻息肉組織嗜酸性粒細胞浸潤。 第三部分：鼻息肉組織Th細胞分化相關轉錄因子表達 背景 鼻息肉的發(fā)生機制尚不確定，關于鼻息肉的發(fā)生機制，主要存在兩種學說之爭，即金黃色葡萄球菌超抗原學說和真菌變態(tài)反應學說。細菌、病毒、真菌及變應原等可能作為最初的觸發(fā)因素引起鼻腔外側壁的炎癥而

13、發(fā)展形成鼻息肉。 幼稚CD4細胞分化為成熟的Th細胞亞群是機體防御機制和免疫介導疾病發(fā)病機制的關鍵過程，Th細胞分化決定免疫應答的性質(zhì)。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF，功能是促進細胞免疫，增強吞噬細胞介導的抗感染機制；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13，功能是促進B細胞增殖、分化和產(chǎn)生抗體，增強B細胞介導的體液免疫應答，在變態(tài)反應和機體抗寄生蟲免疫中發(fā)揮作用。局部環(huán)境中的細胞因子以及細胞

14、內(nèi)關鍵轉錄因子在Th分化中起主要作用。 本實驗對合并與不合并AR的鼻息肉及對照下鼻甲液氮冷凍標本采用實時熒光定量PCR法測定Th1細胞分化相關轉錄因子T-bet和Th2細胞分化相關轉錄因子GATA-3 mRNA表達，以進一步明確合并與不合并AR的鼻息肉組織在Th細胞分化和免疫應答類型方面的差異，評價金葡菌感染和真菌變態(tài)反應因素在不同類型鼻息肉病因?qū)W中的作用，評價金黃色葡萄球菌超抗原學說和真菌變態(tài)反應學說對鼻息肉不同類型發(fā)生形成的

15、意義，指導鼻息肉分型和綜合治療。 方法 標本為液氮冷凍標本，包括對照下鼻甲組織10例，不合并AR的鼻息肉16例及合并AR的鼻息肉16例。根據(jù)試劑使用說明用TRIzol Reagent從液氮冷凍下鼻甲和鼻息肉組織提取總RNA；DNA 酶Ⅰ去除基因組 DNA；使用逆轉錄酶及2μg提取的總RNA合成cDNA；實時熒光定量PCR在30μl容積中進行：其中包含27.5μl TaqMan Universal PCR Master M

16、ix，0.6 μl正向引物，0.6μl反向引物，0.3μl探針和1μl模板(100ng)。反應條件為：95℃ 3 min預變性，然后(95℃變性20s，60℃的退火/延伸20s)×60循環(huán)。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因表達做內(nèi)參。實時熒光定量PCR在實時熒光定量PCR儀BIO RADIcycler 5中進行，用熒光定量PCR分析軟件Icycler version3.1.7050進行分析。 結論 鼻息肉組織GATA-