NFKB1和NFΚBIA基因遺傳變異與南方人群鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、研究背景：
　　鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是鼻咽部上皮組織發(fā)生的惡性腫瘤，在世界各國均有發(fā)病，但以中國及東南亞其他各國發(fā)病率為最高。它是我國常見的惡性腫瘤之一，年發(fā)病率為10～25/10萬，占全國惡性腫瘤死亡的2.81％。據(jù)WHO估算，中國NPC發(fā)病占全世界80%以上，其中又以中國南方地區(qū)發(fā)病率為最高，如廣東、廣西、湖南等省，特別是廣東的中部及西部的肇慶、佛山和廣州地區(qū)：在肇慶的四會縣，其發(fā)

2、病率男性為25.12/10萬，女性為12.11/10萬；中山市男性為21.73/10萬，女性為8.66/10萬。全國范圍內(nèi)，鼻咽癌的發(fā)病率由南到北逐漸降低，如最北方的發(fā)病率不高于2～3/10萬，但近年來我國北方地區(qū)的發(fā)病率也逐漸升高。
　　人類對于腫瘤發(fā)病機制的認識經(jīng)歷了一個漫長的過程，從早期的癌變二階段學(xué)說演變到如今的多階段學(xué)說，并形成了腫瘤分子譜的新概念。通過闡明遺傳變異在癌變進程中的意義，可以為進一步確定腫瘤的分子靶標(biāo)提供依

3、據(jù)。
　　鼻咽癌的病因尚不明確，目前認為是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。環(huán)境因素中，咸魚的食用與鼻咽癌的關(guān)聯(lián)很強，吸煙與飲酒也是鼻咽癌可能的危險因素，然而其研究結(jié)論并不一致。但多項研究均顯示，EB病毒感染是鼻咽癌的一個最重要的環(huán)境危險因素。人體感染EB病毒后會產(chǎn)生很多抗體來對抗EB病毒，在鼻咽癌病人的血清中可以測到高滴度的EBV抗體，鼻咽癌活檢組織中有EBV核酸的存在，并且有潛伏膜蛋白1（LMP1蛋白）表達。LMP1基因是第一

4、個被發(fā)現(xiàn)具有致癌潛能，能夠轉(zhuǎn)化細胞系，改變細胞表型的EBV潛在基因。它可以激活多條信號傳導(dǎo)通路，包括NF-kB信號傳導(dǎo)通路，PKA信號傳導(dǎo)通路，JAK3/STATA信號傳導(dǎo)通路以及ERK，P38和JNK通路，介導(dǎo)LMP1表達引發(fā)的各種下游病理效應(yīng)，調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、侵襲以及轉(zhuǎn)移。
　　NF-kB是先天性免疫以及炎癥反應(yīng)的一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)元件，且在許多癌癥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NF-kB的異常表達。NF-kB可以被多種刺激信號誘導(dǎo)激活，其有大量

5、的靶基因，包括編碼抗生物肽、細胞因子、趨化因子、應(yīng)激反應(yīng)蛋白、以及抗凋亡蛋白等的基因。NF-kB活性對于淋巴細胞的存活、活化以及發(fā)動正常的免疫反應(yīng)非常重要。由LMP1激活的NF-kB可以誘導(dǎo)在LPM1介導(dǎo)的腫瘤形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用的相關(guān)基因的表達。因此NF-kB信號通路可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和或與LMP1相互作用，影響鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展。NF-kB信號系統(tǒng)包括兩個蛋白家族，即 NF-κBs家族和IκBs家族，該信號系統(tǒng)通過NF-κB二聚體與

6、IκB的結(jié)合和分離介導(dǎo)信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細胞的許多病理生理過程，包括免疫應(yīng)答、炎癥，細胞增殖、細胞凋亡以及細胞鈣穩(wěn)態(tài)等。最常見的NF-κB二聚體由p50和p65組成，該二聚體通過與IκBa結(jié)合和分離，調(diào)節(jié)其功能，其中p50由NFKB1基因編碼，IκBa由NFΚBIA基因編碼。
　　基因單核苷酸多態(tài)(SNP)可通過影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力而影響基因的表達，從而與腫瘤發(fā)病相關(guān)?；贕enbank單核苷多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(http://www.nc

7、bi.nlm.nih.gov/)的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NFKB1基因啟動子區(qū)僅存在一個常見多態(tài)位點(最小等位基因頻率>5%)，即-94ins/delATTG(rs28362491)，2758G>A(rs696)和-826C>T(rs2233406)分別為NFΚBIA基因3’UTR區(qū)和啟動子區(qū)的常見多態(tài)位點為，進一步的功能分析(http://snpinfo.niehs.nih.gov/)顯示以上位點皆是潛在的功能性位點。因此，本課題擬采用

8、病例-對照研究方法，通過檢測NFKB1基因-94ins/delATTG多態(tài)及NFΚBIA基因2758G>A、-826C>T多態(tài)在NPC病例和對照組中的基因型，分析NFKB1及NFΚBIA多態(tài)與人群NPC發(fā)病的關(guān)聯(lián)，并通過體外構(gòu)建報告基因質(zhì)粒，進一步對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果進行功能驗證，闡述NFKB1和NFΚBIA多態(tài)與我國南方人群NPC發(fā)病的關(guān)聯(lián)的分子生物學(xué)實質(zhì)。
　　研究目的：
　　研究NFKB1基因-94ins/delATTG多態(tài)

9、和NFΚBIA基因2758G>A、-826C>T多態(tài)與我國南方人群NPC發(fā)病的關(guān)聯(lián)，并分析基因與環(huán)境暴露因素在NPC發(fā)病中的交互作用，最后通過關(guān)聯(lián)位點的生物學(xué)功能實驗闡述基因遺傳變異與NPC發(fā)病關(guān)聯(lián)的分子生物學(xué)實質(zhì)，為NPC的防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法：
　　運用病例-對照研究的方法，于2007年8月～2011年11月連續(xù)收集廣州市區(qū)及周邊共四所醫(yī)院新診斷的經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實的原發(fā)性NPC病例906例，按性別相同、年

10、齡±5歲頻率配比原則于同期參加社區(qū)健康體檢的10000名體檢者中隨機選取906例健康人作為對照。
　　采用Taqman基因分型技術(shù)檢測NFKB1基因-94ins/delATTG(rs28362491)多態(tài)位點和NFΚBIA基因2758G>A(rs696)、-826C>T(rs2233406)多態(tài)位點的基因型，預(yù)先針對不同等位基因設(shè)計的兩條探針于5’端分別標(biāo)記FAM基團(藍色)和VIC基團(紅色)，3’端標(biāo)記淬滅螢光MGB基團，在A

11、BI7500系統(tǒng)基因分型模塊上，根據(jù)不同顏色螢光值判別基因型；為驗證基因型判斷的準確性，從NPC病例和健康對照中分別隨機選取30個樣本進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行測序驗證。
　　采用SAS9.13軟件進行χ2檢驗以分析性別、年齡、吸煙、飲酒、家族腫瘤史、各多態(tài)位點不同等位基因及基因型在病例組和對照組間頻率分布的差異。進行Hardy—Weinberg平衡檢驗，比較對照組實際基因型頻率與預(yù)期基因型頻率的吻合程度，判斷對照組人群選擇的代

12、表性。采用多因素非條件Logistic回歸，分析NFKB1基因-94ins/delATTG多態(tài)、NFΚBIA基因2758G>A和-826C>T多態(tài)與人群NPC的危險性關(guān)聯(lián)，同時分析變異等位基因與NPC發(fā)病風(fēng)險的劑量-效應(yīng)關(guān)系；所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，檢驗水準為α=0.05，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　采用體外質(zhì)粒構(gòu)建與報告基因檢測技術(shù)分析關(guān)聯(lián)結(jié)果的功能機制：選擇2758G>A位點為GG基因型的DNA樣本，PCR擴增296bp的

13、NFΚBIA基因的3’UTR區(qū)（相對于翻譯終止子下游+1bp到+296bp的序列），將PCR產(chǎn)物連接到psiCHECK-2 basic載體上，酶切、測序鑒定。之后應(yīng)用定點突變技術(shù)，將2758G等位基因突變?yōu)?758A等位基因，即構(gòu)建含不同2758G>A等位基因的螢光素酶報告基因質(zhì)粒。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NFΚBIA基因2758G>A變異會影響miR-449a和miR-34b結(jié)合到mRNA的能力，因此，將上述報告基因質(zhì)粒單獨或與microR

14、NA模擬物或microRNA抑制劑共轉(zhuǎn)染鼻咽癌細胞系CNE-1和CNE-2，在生物發(fā)光檢測儀上檢測不同質(zhì)粒的螢光素酶活性水平。采用t檢驗分析體外螢光素酶報告基因?qū)嶒灥慕Y(jié)果。
　　研究結(jié)果：
　　1.1人口學(xué)基本特征
　　共收集NPC病例906例，并配比收集對照906例。其中，NPC病例按臨床分期有I期40例，II期244例，III期338例，IV期284例；EBV感染者723例，未感染者183例；單因素分析發(fā)現(xiàn)，性別、

15、年齡在病例與對照組的分布無顯著差異(P性別=1.000，P年齡=0.661)，吸煙在病例與對照間分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P吸煙=0.021)，飲酒、癌癥家族史在病例組和對照組的分布無統(tǒng)計學(xué)差異(P飲酒=0.531，P癌癥家族史=0.123)。
　　1.2 NFΚB1與NFΚBIA基因多態(tài)與NPC發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)分析
　　所研究三個多態(tài)位點各基因型在對照人群中的頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(NFKB1-94ins/

16、delATTG:c2=1.126,P=0.289;NFΚBIA2758G>A:c2=1.486,P=0.223;
　　NFΚBIA-826C>T:c2=0.702,P=0.402)。NFΚBIA2758G>A多態(tài)基因型在病例與對照組間頻率分布差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。
　　分析發(fā)現(xiàn)，NFKB1-94ins/delATTG基因型del/delATTG、ins/delATTG、ins/insATTG在病例和對照組中

17、的頻率分別為18.76%、51.55%、29.69%和21.30%、47.79%、30.91%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.227）。
　　NFΚBIA啟動子區(qū)-826C>T基因型CC、TC、TT在病例組和對照組中的頻率分別為77.92%、20.42%、1.66%和76.60%、22.19%、1.21%，差異亦無顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.501)。
　　對于NFΚBIA3’UTR區(qū)2758G>A多態(tài)，以GG基因型個體為參照，A

18、A基因型攜帶者發(fā)生NPC的危險顯著上升(adjustedOR=1.32;95%CI=1.01-1.72)；在隱形模型AA vs（GG+AG）中，AA基因型攜帶者患NPC的危險是攜帶G等位基因者的1.39倍(adjustedOR=1.39;95%CI=1.11–1.74)。進一步通過NFΚBIA基因-826C>T和2758G>A兩個多態(tài)位點的單體型分析，發(fā)現(xiàn)其在病例組與對照組中的分布差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.005），與T-G單體

19、型相比，攜帶C-A和T-A單體型的個體發(fā)生鼻咽癌的風(fēng)險顯著增加（C-A:adjustedOR=1.32,95%CI=1.04-1.67;
　　T-A:adjustedOR=3.21;95%CI=1.93-5.33）。分層分析發(fā)現(xiàn)2758AA變異純合子對鼻咽癌的危險效應(yīng)在EBV感染者中更(adjustedOR=1.55,95%CI=1.23-1.95)顯著，而其他環(huán)境暴露因素各亞層中NFΚBIA2758G>A多態(tài)位點各基因型在病例與

20、對照組中的頻率分布無顯著差異；非條件logistic回歸分析未發(fā)現(xiàn)基因與環(huán)境因素之間存在交互作用。
　　1.3 NFΚBIA3’UTR區(qū)2758G>A轉(zhuǎn)錄活性檢測
　　關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)NFΚBIA2758G>A多態(tài)位點與NPC發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，為從功能上解釋這個關(guān)聯(lián)結(jié)果，我們通過體外克隆技術(shù)結(jié)合定點誘變，分別成功構(gòu)建含2758G等位基因和2758A等位基因的螢光素酶報告基因質(zhì)粒(p2758G和p2758A)，并轉(zhuǎn)染人鼻咽癌細胞系CN

21、E-1和CNE-2。結(jié)果顯示兩個細胞系內(nèi)p2758A質(zhì)粒的Luciferase活性水平都顯著低于p2758G質(zhì)粒的Luciferase活性水平(P值分別為0.008，0.011)。
　　生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NFΚBIA基因2758G>A變異會影響miR-449a和miR-34b結(jié)合mRNA的能力，因此進一步將報告基因質(zhì)粒與microRNA模擬物或者抑制劑共轉(zhuǎn)染細胞系CNE-1和CNE-2，進行螢光素酶活性檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩個細胞系

22、中，miR-449a模擬物能降低報告基因質(zhì)粒p2758A的相對螢光值（P=0.002 for CNE-1 and P=0.032 for CNE-2），相反miR-449a抑制劑能顯著上調(diào)報告基因質(zhì)粒p2758A的相對螢光值（P<0.001 for CNE-1 and P=0.039 for CNE-2），但是質(zhì)粒與miR-34b模擬物共轉(zhuǎn)染實驗并未發(fā)現(xiàn)miR-34b模擬物對兩種報告基因質(zhì)粒的螢光素酶活性水平有任何顯著的影響。