骨髓間充質(zhì)干細胞對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡的保護作用.pdf

1、目的：
　　1.建立重癥急性胰腺炎胰腺腺泡損傷的動物模型。
　　2.建立一種分離、純化、擴增，CM-Dil標記骨髓間充質(zhì)干細胞方法。
　　3.通過骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療胰腺腺泡損傷的大鼠，評價其對重癥急性胰腺炎大鼠胰腺功能的保護作用。
　　方法：
　　1.膽胰管逆行注射?；悄懰徕c造成大鼠急性出血壞死型胰腺炎（AHNP）模型，將大鼠隨機分為2組，麻醉、開腹，以24G靜脈套管針于對側(cè)腸壁刺入腸腔，循乳頭將軟套

2、管穿入主胰膽管約0.5cm。3％牛磺膽酸鈉溶液30 mg/kg以12 ml/h泵入。對照組作假手術(shù)。
　　2.差異貼壁法獲得MSCs：剪開大鼠股骨和脛骨的骨端，用DMEM+F12不斷沖洗。加入Ficoll分離液離心后用培養(yǎng)液重懸、接種、培養(yǎng)。觀察細胞貼壁情況，待生長至培養(yǎng)瓶面積80%-90%時1:3傳代。以后1:2傳代。
　　3.取第3代MSCs用羰花青熒光染料CM-DiI(Chlormethylbenzamido-1，1

3、dioctadecyl-3，3，3ˊ，3ˊ-tetramethylindocarbocyamine)標記。于造模后30MIN尾靜脈注射，1×106/100 mg。對照組注射等量生理鹽水。分批處死大鼠，檢測血液和腹水的指標。胰腺組織行快速冰凍、HE染色、電鏡觀察和RT-PCR。
　　結(jié)果：
　　1.造模組6小時起，血淀粉酶水平顯著升高，至12小時達到高峰，病理評分至12-24h達到頂點，12h胰腺的病理評分為5.01+1.3。

4、顯微鏡下觀察，造模后12h可見間質(zhì)水腫、中性粒細胞浸潤、散在腺泡細胞壞死，至24h可見大片壞死、腺泡結(jié)構(gòu)破壞、出血及脂肪壞死。
　　2.顯微鏡觀察原代接種48h后細胞貼壁，培養(yǎng)1W細胞匯合達到90％左右。傳至第3代時，細胞形態(tài)單一,呈膜狀鋪展。流式檢測顯示，至P3代時，CD29+CD90+CD34-CD45-群達到95%以上,經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化茜素紅染色陽性,經(jīng)成脂誘導(dǎo)油紅染色陽性。對照組均為陰性。
　　3. MSCs組比SAP

5、組血清的淀粉酶有顯著下降并在12小時達到高峰，血清TNF-α水平在治療后12h、24h顯著低于SAP組（P<0.05）。胰腺冰凍觀察可見CM-DiI陽性細胞,電鏡觀察，SAP組胰腺腺泡出現(xiàn)損傷改變。MSCs干預(yù)組損傷較輕。PCR測定顯示在干細胞治療組中的AQP1的量明顯高于SAP組。
　　結(jié)論：
　　1.牛磺膽酸鈉膽胰管逆行注射成功制作實驗性SAP大鼠模型。
　　2.差異貼壁法能獲得高純度的MSCs，為后續(xù)實驗提供了充