轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-,2-誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡及侵襲過(guò)程中的機(jī)制研究.pdf

1、白內(nèi)障是世界范圍內(nèi)的主要致盲原因,目前還沒(méi)有藥物或者營(yíng)養(yǎng)性的治療可以消除已經(jīng)存在的白內(nèi)障或者延緩其進(jìn)展,通過(guò)手術(shù)摘除白內(nèi)障是主要的治療方法.但由于植入人工晶體后失去調(diào)節(jié)能力以及存在發(fā)生后發(fā)性白內(nèi)障(after cataract,或稱(chēng)為后囊膜混濁,posterior capsular opacification,PCO)和眼內(nèi)炎癥反應(yīng)的可能,等等問(wèn)題的出現(xiàn),都在一定程度上影響了治療的效果<'[1]>.更需要指出的是,發(fā)生PCO和需要行二次

2、激光手術(shù)的患者主要是年輕人,尤其是兒童<'[2]>,以及糖尿病性視網(wǎng)膜病變<'[3]>或者外傷性白內(nèi)障<'[4]>的患者.因此,研究明確白內(nèi)障以及后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理,從而尋求更為安全有效的非手術(shù)的防治方法是非常重要的. 前期的研究都說(shuō)明,TGF-β<,2>在誘導(dǎo)前囊膜下白內(nèi)障形成和促進(jìn)后發(fā)性白內(nèi)障形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用.隨著TGF-β<,2>對(duì)晶狀體作用的研究不斷深入,TGF-β<,2>發(fā)揮作用的機(jī)理受到廣泛的重視和研究,

3、本課題主要從研究TGF-β誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)理入手,發(fā)現(xiàn)和分析了活性氧在該過(guò)程中發(fā)揮的重要調(diào)控作用;在此研究的同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)TGF-β<,2>處理后,仍有大部分晶狀體上皮細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生凋亡,表現(xiàn)出對(duì)TGF-β<,2>處理的耐受并發(fā)生明顯的侵襲,我們對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了分析后發(fā)現(xiàn),整合素β<,1>及其介導(dǎo)的蛋白激酶通路在該過(guò)程中作用明顯.在總結(jié)了以往關(guān)于TGF-β與白內(nèi)障相關(guān)性研究的基礎(chǔ)上,本研究就TGF-β<,2>對(duì)晶狀體在各種生理病

4、理狀態(tài)下的影響進(jìn)行了分析,對(duì)于全面闡明該細(xì)胞因子對(duì)晶狀體的作用和作用機(jī)理做出了積極的工作. 第一部分 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡—— 活性氧的調(diào)節(jié)作用 [研究目的]：研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β<,2>(transforming growth factorβ<,2>TGF.β<,2>)能夠抑制人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells,HLECs)的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,該過(guò)程

5、與晶狀體前囊膜下渾濁密切相關(guān),但是這兩種過(guò)程中的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制仍不明了.活性氧(reactive oxygen species,ROS)作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子參與了眾多的細(xì)胞損傷過(guò)程,因此,我們的本部分的研究目的是研究ROS在TGF-β<,2>對(duì)HLECs的損傷過(guò)程中的作用,進(jìn)而明確TGF-β<,2>對(duì)HIJECs的損傷機(jī)制. [研究方法]： 體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞株HLEB-3,用不同濃度的TGF-β<,2>處

6、理后,分別采用MTT和nJNEL法分析TGF-β<,2>對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響.應(yīng)用熒光染料DCFHDA,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量改變;并且,我們測(cè)定了細(xì)胞還原型谷胱甘肽(GSH)的含量以及采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法測(cè)定了c-fos基因的mRNA含量的變化.最后,我們通過(guò)應(yīng)用不同的活性氧清除劑,抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的升高,測(cè)定對(duì)TGF-β<,2>誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡兩個(gè)過(guò)程的影響. [研究結(jié)果]： TGF-β<,2>是晶狀體

7、上皮細(xì)胞重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子,并且可以引起細(xì)胞的凋亡.量效研究發(fā)現(xiàn)100 pg/ml TGF-β<,2>將引起細(xì)胞凋亡,而10 pg/mlTGF-β<,2>即可抑制細(xì)胞的增殖.在100pg/mlTGFβ<,2>引起HLECs凋亡的早期發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯增高,并且降低了細(xì)胞內(nèi)GSH含量,說(shuō)明TGβ<,2>可以引起對(duì)HLECs的氧化性損傷.我們同時(shí)在研究c-fos這一受氧化狀態(tài)調(diào)節(jié)的重要基因的.mRNA表達(dá)中發(fā)現(xiàn),只有高濃度的TGF-β

8、<,2>(100 pg/m1)可以引起該基因的表達(dá)增高,其表達(dá)的變化情況和細(xì)胞經(jīng)過(guò)氧化氫處理后的情況相似.最后,應(yīng)用活性氧清除劑可以明顯降低甚至阻止細(xì)胞發(fā)生凋亡,但是不能改善細(xì)胞增殖受抑制的狀態(tài). [研究結(jié)論]： TGF-β<,2>能夠明顯抑制HLECs的增殖;并在達(dá)到一定濃度后誘導(dǎo)HLECs發(fā)生凋亡.ROS參與了TGF-β<,2>誘導(dǎo)凋亡的過(guò)程. 第二部分 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β<,2>誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞移行和粘

9、附--整合素β<,1>及其相關(guān)的蛋白激酶通路的作用 [研究目的]： 在第一部分內(nèi)容的基礎(chǔ)上我們發(fā)現(xiàn),TGF-β<,2>處理后,仍有大部分晶狀體上皮細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生凋亡,表現(xiàn)出對(duì)TGF-β<,2>處理的耐受并出現(xiàn)出一定的侵襲現(xiàn)象.結(jié)合目前的其他研究的結(jié)果,白內(nèi)障囊外摘除術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞是形成后發(fā)性白內(nèi)障的重要原因,TGF-β<,2>也是參與該過(guò)程并起重要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子之一.因此,本部分的研究在第一部分的基礎(chǔ)上,進(jìn)一

10、步發(fā)現(xiàn)了TGF-β<,2>對(duì)HELCs粘附和移行能力的影響,重點(diǎn)研究整合素β<,1>,這一在調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和移行方面重要的細(xì)胞表面分子的作用,以及整合素相關(guān)的粘著斑激酶 (focal adhesion kinase,FAK)的活化情況.進(jìn)一步分析和闡明了TGF-β<,2>促進(jìn)后發(fā)性白內(nèi)障形成的機(jī)理. [研究方法]： 培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞株HLE B-3,用100 pg/ml的TGF-β<,2>處理后,檢測(cè)細(xì)胞粘附和移行的

11、改變.通過(guò)激光共聚焦及流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)整合素β<,1>亞型的蛋白表達(dá),應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)整合素β<,1>的mRNA的表達(dá).用Westem-blot法分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總FAK及其磷酸化Tyr 576蛋白的表達(dá)情況.最后,使用抗整合素β<,1>的單克隆抗體阻斷細(xì)胞內(nèi)整合素β<,1>后,檢測(cè)對(duì)細(xì)胞粘附和移行的影響. [研究結(jié)果]： TGF-β<,2>可以引起HLECs的凋亡,但仍有>70﹪的細(xì)胞存活下來(lái).TG

12、F-β<,2>的處理能夠引起該部分細(xì)胞粘附和移行力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)明顯升高;同時(shí),細(xì)胞內(nèi)整合素β<,1>的表達(dá)明顯升高(P<0.05);其相關(guān)的FAK的磷酸化水平明顯升高(P<0.05).應(yīng)用抗整合素β<,1>的單克隆抗體預(yù)處理細(xì)胞后,能夠明顯抑制TGF-β<,2>引起的細(xì)胞粘附和移行. [研究結(jié)論]： TGF-β<,2>能夠明顯促進(jìn)HLECs的粘附和移行;整合素β<,1>及其相關(guān)的FAK的磷酸化參與了該過(guò)程并發(fā)揮重要作用