組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及反義HDAC1對MCF-7細(xì)胞影響的實驗研究.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)乙?；腿ヒ阴；墙M蛋白翻譯后修飾的主要方式，是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一個重要因素，越來越多的實驗表明組蛋白乙?；氖Ш馀c腫瘤發(fā)生存在著密切的聯(lián)系，平衡的打破成為某些腫瘤形成或發(fā)展的直接因素。本實驗中我們從藥物制滴菌素(trichostatinA，TSA)及基因水平阻斷組蛋白去乙酰化酶，抑制組蛋白去乙?；富钚曰蛳抡{(diào)其基因表達(dá)，觀察處理因素所致的細(xì)胞效應(yīng)，探討乙酰化與去乙?；揎椩贛CF-7細(xì)胞中的影響。 實驗中我們發(fā)現(xiàn)TSA作用

2、后，MCF-7細(xì)胞活性下降，隨時間的延長及劑量的增加，細(xì)胞效應(yīng)更加明顯，呈現(xiàn)時間和劑量依賴性；ADnexin-V/PI凋亡分析顯示在不同梯度濃度的TSA作用48h后，McF-7細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，隨著劑量的增加凋亡率逐步升高；周期實驗分析顯示0.50μmol/L的TSA作用48h、72h后，與空白對照相比，MCF-7細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的G2期阻滯，但無凋亡出現(xiàn)；進(jìn)一步的的瓊脂糖電泳實驗顯示0.50μmol/L TSA作用無明顯的180-200bp的

3、梯度出現(xiàn)；其后的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分析顯示除．P21基因上調(diào)外，ERa、myc-c、eyelin-D及Bcl-2均下調(diào)，同朝著增殖抑制、周期阻滯及凋亡的方向發(fā)展，表明TSA有效地引起了基因轉(zhuǎn)錄的變化，其所致的細(xì)胞效應(yīng)可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)。 組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)在藥物水平能被阻斷，RNA水平是否也可實施阻斷呢?我們選基因編號為NM 004964的HDACl進(jìn)行阻斷。經(jīng)RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及PCR后

4、，成功擴(kuò)增目的片段，反向插入該片段入pcDNA3.1(-)真核表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定及測序分析，表明成功構(gòu)建pcDNA3.1-HDACl反義質(zhì)粒；大量擴(kuò)增、純化目的質(zhì)粒DNA，進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染72h后的HDACl基因分析顯示空白及空質(zhì)粒組目的基因無明顯變化，反義組條帶強(qiáng)度明顯比空白及空質(zhì)粒組弱，凝膠灰度分析顯示反義組相對于空質(zhì)粒組下降了57％；此外，還發(fā)現(xiàn)陽性對照TSA組也下調(diào)了HDACl，強(qiáng)度比反義組更明顯。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活性實驗也

5、顯示反義基因具有細(xì)胞增殖抑制作用，反義HDACl降低了MCF-7細(xì)胞的活性，空質(zhì)粒組與空白組與之相比無明顯變化；進(jìn)一步的細(xì)胞流式實驗表明反義基因能使細(xì)胞周期阻滯，使細(xì)胞S期減少，阻滯于G1、G2期。上述實驗表明HDAC可在藥物及基因水平被阻斷，MCF-7細(xì)胞的腫瘤形成中可能存在乙?；c去乙?；揎椀奈蓙y，HDACl是有效的去乙?；?，在乙?；揎椫锌赡芷鹬匾饔茫蛔钄郒DAC酶的活性可引起腫瘤細(xì)胞增殖抑制、周期阻滯或凋亡，HDAC酶可能