胰島素受體（InsR）與奶牛酮病、脂肪肝糖異生和脂肪動員的關系.pdf

1、以能量代謝障礙為病理學基礎的酮病和脂肪肝是奶牛在圍產期普遍發(fā)生的與肝臟脂質代謝相關的營養(yǎng)代謝性疾病。胰島素受體(InsR)是靶細胞膜上的一種固有糖蛋白，屬于酪氨酸激酶受體家族，即具有受體自動磷酸化激活的酪氨酸激酶活性，它在介導IGF-2和胰島素信號方面發(fā)揮著重要的作用，從而調節(jié)動物新陳代謝活動。本文通過飼養(yǎng)實驗、體外肝細胞原代培養(yǎng)及定量RT-PCR方法，從細胞和分子水平，研究了圍產期奶牛能量代謝狀態(tài)、神經內分泌因子對圍產期正常奶牛、自然

2、發(fā)生酮病和脂肪肝病牛胰島素受體基因表達的調控作用及機理，為防治奶牛酮病和脂肪肝等圍產期能量代謝障礙性提供實驗和理論依據(jù)。 在正常奶牛飼喂試驗中，選取24頭5-8歲、3-5胎泌乳量大于5000Kg的妊娠荷斯坦奶牛，集中單槽飼養(yǎng)，預飼一周后進行飼養(yǎng)試驗。試驗期由產前第28d至產后56d結束，按中國奶牛飼養(yǎng)標準配制的產奶日糧飼喂。產前奶牛每公斤日糧含1.79NND，產后各組奶牛常規(guī)方式飼喂精料，自由攝食干草，整個試驗期間每日早、中和晚

3、定時飼喂。根據(jù)血糖水平，將整個試驗期奶牛分為低血糖組和正常血糖組。在試驗期產前28d、14d和產后1d、14d、28d及56d，分別采集血液，測定血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、血清游離脂肪酸(NEFA)、β-羥丁酸(BHBA)、總膽紅素(TBI)、谷草轉氨酶(AST)、胰高血糖素(GN)、胰島素(INS)等指標。在自然發(fā)病奶牛試驗中，選取自然發(fā)生酮病牛10頭、脂肪肝病牛13頭和正常對照組13頭。分別采取血液，測定項目除上述指標外，增

4、加了血清尿素氮(BUN)、γ-谷氨酰轉移酶(γ-GT)、膽堿酯酶(CHE)、肌酐(Cr)。采取肝組織和尾根部脂肪，同時稱量周體重(BW)、日平均泌乳量(MY)和日平均飼料消耗量，計算干物質攝入量(DMI)。結果表明：①圍產期奶牛易發(fā)生低血糖，表明存在能量負平衡(NEB)，發(fā)生NEB的奶牛大多能在產后28d左右恢復正常；②圍產期奶牛血漿NEFA明顯增加，產后1d血漿NEFA、TBI濃度達最高，產后14d血清BHBA、AST達到最高，隨后逐

5、漸降低，說明圍產期分娩前后奶牛脂肪動員先增強后減弱；圍產期奶牛發(fā)生NEB將加劇奶牛脂肪動員，促進亞臨床酮病的發(fā)生；③圍產期奶牛調節(jié)糖原異生、脂肪動員的血液激素GN、INS及其INS/GN比率都逐漸降低，尤其INS/GN比值明顯下降(＜0.10)，啟動了脂肪動員和肝糖異生作用；④酮病、脂肪肝奶牛泌乳量明顯下降，血糖顯著降低，血漿NEFA和BHBA明顯增高；酮病、脂肪肝奶牛肝脂含量分別為18.8％和41.9％。酮病奶牛血清AST、γ-GT、

6、TBI、CHE等多項指標呈現(xiàn)升高的趨勢，提示可能存在肝功能不全。脂肪肝奶牛血清AST、γ-GT、TBI、CHE等多項肝功能指標明顯增高，表明其肝功能不全。血清Cr顯著升高，顯示腎功能可能也受到影響。 根據(jù)GENEBANK發(fā)表的牛InsR、β-actin的cDNA序列，設計兩對引物，分別成功擴增出147bp的InsR基因片段和351bp的β-actin基因片段，分別構建含牛InsR基因、β-actin基因的載體，測序結果InsR、

7、β-actin目的基因的同源性分別達到95％、100％。建立和優(yōu)化了肝InsRmRNA半定量RT-PCR檢測方法，其適宜的PCR反應條件：退火溫度為60℃、Mg2+終濃度為2.4mmol/l、循環(huán)次數(shù)為30次、cDNA最小檢測限為5.2ng/ml，反應體積25ul。選擇攝入不同能量的圍產期24頭奶牛的肝臟和脂肪組織，自然發(fā)生酮病奶牛、病死的脂肪肝奶牛和正常對照組圍產期奶牛各5頭的肝臟組織樣品，利用半定量RT-PCR檢測方法，觀測了Ins

8、R基因的表達變化。結果表明：①干乳期高能飼喂，下調產后奶牛肝臟和脂肪組織InsRmRNA豐度，脂肪動員增加，血液中NEFA及酮體濃度高，加重產后奶牛能量負平衡。干乳期低能飼喂，上調產后奶牛肝臟和脂肪組織InsRmRNA豐度，抑制脂肪動員，促進糖原合成，維持血糖濃度相對恒定，緩解機體能量負平衡，提高奶牛的生產性能。這些變化與血液INS、GN和INS/GN的變化有關。②酮病組奶牛InsRmRNA表達下降，提示此有利于酮病奶牛糖異生和脂肪動員

9、，從而緩解能量負平衡；脂肪肝奶牛InsRmRNA相對表達量顯著降低，提示奶牛胰島素應答顯著減弱，此時奶?？赡馨l(fā)生了胰島素抵抗。 同時，采用體外牛肝細胞原代培養(yǎng)技術和牛肝InsRmRNA半定量RT-PCR檢測方法，觀測了添加不同濃度的胰島素(0nmol/l、1nmol/l、10nmol/l、100nmol/l、1000nmol/l)、胰高血糖素(0nmol/l、1nmol/l、10nmol/l、100nmol/l、1000nmol