miR-196a基因及其結(jié)合位點多態(tài)性與食管鱗癌的關(guān)聯(lián)及機(jī)制研究.pdf

1、食管癌是人類最常見的惡性腫瘤之一,多發(fā)于亞洲和非洲,其發(fā)病有明顯的種族人群差異。食管癌分為食管腺癌(EsophagealAdenocarcinoma,EA)和食管鱗狀細(xì)胞癌(EsophagealSquamousCellCarcinoma,ESCC),中國是食管癌的高發(fā)區(qū),以食管鱗狀細(xì)胞癌為主。但不同地區(qū)食管癌的發(fā)病類型和發(fā)病率也不相同。中國食管癌高發(fā)區(qū)主要分布于河南、河北、山西、陜西、四川以及東部地區(qū),其中河南省主要以家族遺傳性為主,而

2、西南地區(qū)主要顯示出散發(fā)性特征。重慶地處四川盆地東南部,為食管癌高發(fā)區(qū)之一。根據(jù)重慶市城市居民惡性腫瘤死因分析報告,在惡性腫瘤中,食管癌死亡率為25.85/10萬,占13.37％。目前,食管癌術(shù)后5年生存率僅為18-30%,是高致死性的疾病。因此,研究其發(fā)病機(jī)理,尋找早期診斷及治療的靶點是現(xiàn)今亟待解決的問題。
　　食管癌是基因-基因、基因-環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。大量的研究表明,人群遺傳背景的基因多態(tài)性可以通過影響相關(guān)基因的功能,對

3、腫瘤易感性發(fā)揮重要的作用。在人類基因組計劃以及千人基因組計劃取得巨大成就的背景下,以單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)為標(biāo)記進(jìn)行腫瘤等常見復(fù)雜疾病的遺傳易感性研究取得了巨大的進(jìn)展,其中包括候選基因的關(guān)聯(lián)分析(CandidategeneAssociationStudy)和全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-WideAssociationStudy,GWAS)兩種策略,關(guān)聯(lián)分析已成為后基因組時代復(fù)

4、雜疾病遺傳學(xué)研究的熱點之一。因此,結(jié)合中國西南地區(qū)食管鱗癌人群病例樣本和相應(yīng)的臨床資料,探討食管鱗癌的遺傳易感性,對深入認(rèn)識食管鱗癌的病因及發(fā)病機(jī)制,發(fā)掘食管鱗癌易感的遺傳標(biāo)志,提高食管鱗癌的預(yù)防和治療水平具有重要的意義。
　　MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的長度約22個核苷酸的非編碼RNA,作為一種基因表達(dá)調(diào)控分子,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖、分化和凋亡等基本生命活動。研究表明,miRNA的突變或者表達(dá)異常與多種人類腫瘤

5、相關(guān),miRNA可以調(diào)控重要的腫瘤相關(guān)基因,發(fā)揮腫瘤抑制基因或者癌基因的功能,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,對腫瘤的診斷和治療也具有重要意義。成熟的miRNA是由RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物primary-miRNA(pri-miRNA),經(jīng)RNaseⅢDrosha和RNaseⅢDicer剪切加工生成。成熟的miRNA與Ago等蛋白一起組成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,R

6、ISC),通過與其靶基因3’非翻譯區(qū)(UntranslatedRegion,UTR)的互補(bǔ)結(jié)合,降解靶基因的mRNA或抑制其翻譯,從而調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA主要依賴其seed區(qū)(2-8堿基)與靶基因的3'UTR互補(bǔ)結(jié)合,結(jié)合位點序列決定了miRNA發(fā)揮作用的特異性。因此,任何對miRNA基因的轉(zhuǎn)錄、加工成熟及其與靶基因結(jié)合等環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響的因素,都將導(dǎo)致miRNA表達(dá)或功能改變,與疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　　迄今為止,應(yīng)用SNP關(guān)

7、聯(lián)分析進(jìn)行基因多態(tài)性與食管癌易感性研究已取得很大進(jìn)展。大多數(shù)報道的與食管癌相關(guān)聯(lián)的SNP位點位于基因的啟動子和外顯子區(qū),對基因3'UTR的SNP位點,以及miRNA基因的SNP位點的研究還較少。目前,HapMAP數(shù)據(jù)庫公布人類基因組中大約存在1,500萬個常見的SNP。在全基因組范圍內(nèi),編碼miRNA的基因及多數(shù)蛋白編碼基因的3'UTR也存在大量的SNP位點,這些SNP位點可能會影響miRNA的轉(zhuǎn)錄、加工生成,或影響miRNA與靶基因3

8、'UTR結(jié)合能力的變化甚至是結(jié)合位點的改變,從而導(dǎo)致所調(diào)控的靶基因表達(dá)或功能改變,影響個體對腫瘤的易感性。因此,結(jié)合miRNA基因的產(chǎn)生過程以及作用方式,本課題從編碼miRNA基因的SNP,及蛋白編碼基因3'UTR的miRNA結(jié)合位點SNPs兩個方面,采用候選基因SNPs關(guān)聯(lián)分析策略,探討發(fā)掘與中國西南地區(qū)食管鱗癌遺傳易感相關(guān)的SNPs,并對陽性關(guān)聯(lián)SNP位點進(jìn)行功能研究。
　　本課題的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.RA

9、P1A基因3'UTR的SNPrs6573與食管鱗癌發(fā)病及轉(zhuǎn)移風(fēng)險顯著相關(guān)。
　　首先通過生物信息學(xué)以及文獻(xiàn)資料,篩選出與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因。綜合利用Diana-microT、Target-scan、miRBase、miRanda、PicTar以及microinspector預(yù)測miRNA的結(jié)合位點。在NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫(Build130)中對miRNA靶基因的3'UTR進(jìn)行BLAST和BLAST-SNP,然后使用RN

10、Ahybrid工具中的自由能總值(△△G)評價這些SNP對“miRNA-靶基因”相互作用的影響。在HapMAP數(shù)據(jù)庫中查看這些SNP在中國漢族人群中的頻率,篩選標(biāo)準(zhǔn):MAF>5%。依據(jù)上述方法和原則,我們選取了BIRC5、FGF2、RAP1A、TGFA、DICER、COL4A2和DGCR8基因的7個miRNA靶點相關(guān)的SNPs位點。利用537例ESCC病例及608例正常對照,通過SNapShot基因分型及關(guān)聯(lián)分析,研究SNPs位點多態(tài)性

11、與ESCC的發(fā)生及轉(zhuǎn)移風(fēng)險性之間的關(guān)聯(lián)性,結(jié)果顯示:位于RAP1A基因3′UTR區(qū)的SNPrs6573C/A位點與ESCC的發(fā)病相關(guān),多因素的logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)SNPrs6573的CC基因型的患病風(fēng)險高于CA(OR,0.31;95%CI:0.23–0.41)或AA基因型(OR,0.43;95%CI:0.21–0.91),提示C等位基因是ESCC的風(fēng)險等位。進(jìn)一步對臨床分期進(jìn)行分層分析,rs6573C/A等位基因在不同的臨床分期

12、之間的分布均顯示出差異(P=0.03,OR=1.89;95%CI:1.06–3.36),提示此位點與食管鱗癌的臨床分期存在關(guān)聯(lián)。
　　2.SNPrs6573通過影響miR-196a對RAP1A的表達(dá)調(diào)控參與了食管鱗癌的轉(zhuǎn)移。RAP1A屬于小分子G蛋白Ras超家族成員之一,在調(diào)控細(xì)胞生長,遷移和形態(tài)改變中都發(fā)揮著十分重要的作用,其表達(dá)及活性異常與腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關(guān)。生物信息學(xué)分析SNPrs6573位點位于RAP1A基因的3'UTR

13、區(qū),存在于miR-196a潛在結(jié)合區(qū),提示RAP1A基因表達(dá)可能受到miR-196a調(diào)控,SNPrs6573A/C等位變異可影響miR-196a與對RAP1A的調(diào)控作用。我們對SNPrs6573A/C的功能研究取得以下結(jié)果:
　　(1)通過構(gòu)建SNPrs6573A/C不同基因型RAP1A3'UTR的載體,采用熒光素酶報告基因的方法研究發(fā)現(xiàn),miR-196a可以顯著降低A等位基因的熒光素酶活性,而對C等位基因的熒光素酶活性沒有影響。

14、進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染miR-196amimics到不同基因型的細(xì)胞株中,發(fā)現(xiàn),miRNA-196a可以降低AC雜合子細(xì)胞株的RAP1A的mRNA以及蛋白的表達(dá),而對CC純合子基因型的細(xì)胞沒有作用。
　　(2)通過檢測食管鱗癌組織中RAP1A的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),在大部分的食管鱗癌組織中RAP1A的表達(dá)都比相鄰正常組織表達(dá)高,另外CC基因型的組織RAP1A的表達(dá)比AC以及AA基因型的表達(dá)高,存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織RAP1A的表達(dá)比不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

15、的組織表達(dá)高。
　　(3)通過體外過表達(dá)或RAP1AsiRNA干擾等實驗,發(fā)現(xiàn)RAP1A對食管癌細(xì)胞的增殖沒有顯著影響,但能促進(jìn)食管癌細(xì)胞的遷移與侵襲。過表達(dá)RAP1A后可以增加
　　MMP2蛋白的表達(dá)而促進(jìn)食管癌細(xì)胞株的遷移與侵襲,而過表達(dá)miR-196a、siRNA干擾RAP1A、過表達(dá)RAP1A的活性抑制基因GAP后降低了MMP2蛋白的表達(dá)而抑制了食管癌細(xì)胞株的遷移與侵襲。
　　上述研究結(jié)果表明:RAP1A是受m

16、iR-196a調(diào)控的一個新的靶基因,rs6573A/C多態(tài)性位點影響miR-196a對RAP1A的結(jié)合及調(diào)控作用。RAP1A可以通過增加MMP2的表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞株的遷移與侵襲,因此rs6573C等位基因通過增加RAP1A的表達(dá)而提高了食管癌轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。本研究結(jié)果證明了SNPrs6573通過影響miR-196a對
　　RAP1A的表達(dá)調(diào)控參與了食管鱗癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。
　　3.SNPrs11614913通過影響miR-196

17、a的生成與食管鱗癌顯著相關(guān)。
　　已有的研究表明,miR-196a的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān),miRNA編碼基因的SNP位點可能會影響miRNA的轉(zhuǎn)錄或生成,影響個體對腫瘤的易感性。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),位于miR-196a的前體區(qū)存在一個SNP位點(pre-miR-196-a2的rs11614913)。為探討此SNPrs11614913多態(tài)性位點與食管鱗癌易感性的關(guān)系,我們采用SNapShot方法,在458例病例及48

18、9例正常對照人群中進(jìn)行了基因分型及關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示:SNPrs11614913CC基因型比TT基因型顯著增加了食管鱗癌的發(fā)病風(fēng)險(OR:2.67;95%CI:1.77–4.04);但與不同的臨床分期無差異(p=0.38);SNPrs11614913與食管鱗癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)在吸煙人群(OR:3.27;95%CI:1.97–5.40)比非吸煙人群(OR1.70;95%CI:0.99–1.70)關(guān)聯(lián)性強(qiáng),提示吸煙與此SNP位點可能存在交互作用。

19、
　　為探討SNPrs11614913的生物學(xué)功能,我們通過構(gòu)建不同基因型的miR-196a表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),攜帶C等位基因的載體成熟miR-196a的表達(dá)明顯高于T等位基因的載體,但pre-miR-196a的表達(dá)量沒有差別。結(jié)果提示SNPrs11614913不影響pre-miR-196a的轉(zhuǎn)錄表達(dá),而可能影響pre-miR-196a到miR-196a的成熟過程。我們進(jìn)一步以體外轉(zhuǎn)錄不同基因型的pre-mi

20、R-196a為探針,通過RNA-proteinpull-down與質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn):C等位基因的pre-miR-196a可以與蛋白NonO(non-POU-domain-containing,octamer-bindingprotein,p54nrb)結(jié)合,而T等位基因的pre-miR-196a不能與此蛋白結(jié)合。結(jié)果提示SNPrs11614913的C等位基因可能通過與NonO蛋白結(jié)合而促進(jìn)了pre-miR-196a的轉(zhuǎn)運(yùn)或者增加其剪切,增加

21、了成熟miR-196a的表達(dá),從而與食管鱗癌的發(fā)生相關(guān)。具體的分子機(jī)制有待更深入的研究。
　　綜上所述,本課題從與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的miRNA基因以及miRNA靶基因兩方面的SNP出發(fā),通過大樣本的病例-對照研究,發(fā)現(xiàn)RAP1A3'UTR的miR-196a結(jié)合位點SNPrs6573和pre-miR-196a的SNPrs11614913兩個SNP位點與中國西南地區(qū)食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān),并證實了這兩個SNP位點參與食管