Flt3L與RANTES細(xì)胞因子佐劑對(duì)抗原特異性免疫應(yīng)答的增強(qiáng)及抗腫瘤作用.pdf

1、目的：抗原特異性免疫應(yīng)答的誘生很大程度上取決于機(jī)體對(duì)該抗原分子的處理和遞呈的效率。樹突狀細(xì)胞(dentritic cells，DCs)是體內(nèi)的專職抗原遞呈細(xì)胞，具有活躍地?cái)z取、處理抗原的能力，可有效地向T細(xì)胞呈遞抗原、激發(fā)初次細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，在抗原注射部位DCs的數(shù)量及其對(duì)抗原的攝取能力是制約抗原特異性免疫應(yīng)答的重要因素?；贒Cs在免疫應(yīng)答中具有重要作用，如果招募包括DCs在內(nèi)的APCs至靶抗原所在部位，增加對(duì)抗原的攝取和遞呈，則

2、有利于增強(qiáng)免疫效果。 Flt3L(fms-like tyrosine kinase 3 ligand)為集落刺激因子家族成員之一，屬于酪氨酸激酶受體，可刺激CD34+造血干細(xì)胞的增殖和分化，并誘導(dǎo)特定亞群的DC細(xì)胞成熟。通過(guò)注射F1t3L可以使抗原特異性免疫反應(yīng)顯著增強(qiáng)，并顯著增加DC的數(shù)量和頻率。另外，F(xiàn)lt3L與多種細(xì)胞因子有協(xié)同作用，是一種良好的DCs細(xì)胞擴(kuò)增劑。RANTES(regulated uponactivatio

3、n normal T cell expressed and secreted)即CCL5是趨化因子CC家族的重要代表之一，主要趨化單核細(xì)胞、初始T細(xì)胞及活化T細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，其趨化活性是MIP-1的10倍。 核酸疫苗作為第三代疫苗，在抗感染、抗腫瘤免疫的研究中有著巨大潛力和應(yīng)用價(jià)值，但由于其免疫原性較低，單獨(dú)使用核酸疫苗很難誘導(dǎo)出具有預(yù)防和治療作用的強(qiáng)大且持續(xù)性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。因而，近些年核酸疫苗的設(shè)計(jì)和研究主

4、要集中在如何提高其免疫原性及誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答上。具有調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子能夠有效激活和調(diào)節(jié)免疫活性細(xì)胞，促進(jìn)其分化和增生，經(jīng)細(xì)胞因子活化后的專職性抗原提呈細(xì)胞能夠有效地激活抗原特異性CTL細(xì)胞。而具有趨化作用的趨化因子能夠趨化抗原提呈細(xì)胞在淋巴組織中的定位，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)的強(qiáng)弱。將細(xì)胞因子或趨化因子與其他一些免疫調(diào)節(jié)分子聯(lián)用，作為佐劑協(xié)同核酸疫苗進(jìn)行免疫，共同調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫細(xì)胞，最終達(dá)到增強(qiáng)免疫效果的目的。本研究中我們克隆了小鼠Fl

5、t3L/RANTES基因，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pFlt3L/pRANTES；另外，為了能通過(guò)小鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究Flt3L及RANTES的分子佐劑效應(yīng)，構(gòu)建了表達(dá)HBc抗原的真核表達(dá)質(zhì)粒pHBc作為模型核酸疫苗，并建立了穩(wěn)定表達(dá)HBcAg的小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16-HBc。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pFlt3L及pRANTES對(duì)攜帶HBc抗原的DNA疫苗誘導(dǎo)的抗原特異性免疫應(yīng)答的促進(jìn)作用。同時(shí)為了能夠更好的誘導(dǎo)出細(xì)胞免疫反應(yīng)，我們

6、采用經(jīng)攜帶HBc抗原的DNA疫苗初免及原核表達(dá)的HBc顆粒蛋白加強(qiáng)免疫的“Prime-Boost”免疫方案免疫小鼠，同時(shí)以真核表達(dá)載體pFlt31和pRANTES作為佐劑，研究了Flt3L/RANTES聯(lián)合應(yīng)用在Prime-boost免疫策略中對(duì)穩(wěn)定表達(dá)HBcAg的小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16-HBc細(xì)胞)攻擊的免疫保護(hù)作用，并對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行了探索。 方法： 1.真核表達(dá)載體pF1t3L、pRANTES的構(gòu)建及F1t3L與

7、RANTES生物學(xué)活性鑒定采用RT-PCR方法從小鼠骨髓及外周血單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增得到F1t3L及RANTES全長(zhǎng)基因片斷，分別克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-His，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pF1t3L和pRANTES。將pF1t3L和pRANTES分別用脂質(zhì)體的方法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，然后采用骨髓細(xì)胞增殖及趨化小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞上清F1t3L及RANTES兩種細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。另外，為了進(jìn)一步檢測(cè)pF1t3L、pRANTES或pF1

8、t3L/pRANTES混合質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)招募炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，以PBS、pcDNA3.1/V5-His、pF1t3L、pRANTES及pF1t3L/pRANTES混合質(zhì)粒，給小鼠腿部肌肉注射，一周后，取注射局部肌肉組織，常規(guī)進(jìn)行石蠟切片及HE染色。 2.真核表達(dá)載體pHBc的構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)HBc的小鼠黑色素瘤B16-HBc的建立構(gòu)建表達(dá)HBcAg的真核表達(dá)質(zhì)粒pHBc作為模型核酸疫苗；同時(shí)將pHBc經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤B

9、16細(xì)胞，G418篩選陽(yáng)性克隆，并分別采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)陽(yáng)性克隆中HBc的表達(dá)，以此作為制備小鼠荷瘤模型的腫瘤細(xì)胞株。 3.用正常小鼠為模型對(duì)重組質(zhì)粒pF1t3L和pRANTES對(duì)DNA疫苗的免疫促進(jìn)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)將pF1t3L和pRANTES單獨(dú)或聯(lián)合使用與攜帶HBc抗原的DNA疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射法免疫小鼠，即將小鼠分為pF1t3L/pHBc組(F組)、pRANTES/pHBc組(R組)及pF1t3L/p

10、RANTES/pHBc組(F/R組)，以pcDNA3.1/V5-His(P組)和pHBc組(H組)為陰性對(duì)照，每2周一次，共免疫3次。采用MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾臟中表達(dá)IFN-γ的CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)、ELISA法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-4含量及乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測(cè)特異性CTL殺傷活性。 4 用荷瘤小鼠模型觀察重組表達(dá)質(zhì)粒pFlt3L和pRANTES在DNA/prime-protein/boost

11、免疫策略中對(duì)免疫應(yīng)答的促進(jìn)作用將兩種重組真核表達(dá)質(zhì)粒pFlt3L和pRANTES聯(lián)合使用作為佐劑與攜帶HBc抗原的DNA疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射進(jìn)行免疫小鼠，然后以大腸桿菌表達(dá)的HBc顆粒蛋白加強(qiáng)，即給小鼠注射兩次pFlt3L/pRANTES/pHBc，一次HBc顆粒蛋白(DDS/Adj)，用DNA疫苗加強(qiáng)(DDD/Adj)或不使用佐劑的DNA疫苗(DDD)做對(duì)照。末次免疫后4天，給小鼠皮下移植穩(wěn)定表達(dá)HBcAg的小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16-HBc

12、，觀察腫瘤生長(zhǎng)，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。然后分別采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA法及乳酸脫氫酶(LDH)釋放法分別檢測(cè)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、小鼠脾臟中表達(dá)IFN-γ的CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)、脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-2、IL-4含量及特異性CTL殺傷活性。 結(jié)果： 1.真核表達(dá)載體pFlt3L/pRANTES的構(gòu)建及B16-HBc小鼠黑色素瘤細(xì)胞株的建立從C57BL/6小鼠骨髓及ConA刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA中，

13、成功克隆了約708bp的Flt3L及271bp的RANTES基因，測(cè)序結(jié)果與GeneBank(AK020105及NM013653)公布的Flt3L及RANTES序列一致；成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pFlt3L和pRANTES：骨髓細(xì)胞增殖及趨化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Flt3L及RANTES均有生物學(xué)活性。pFlt3L、pRANTES和pFlt3L/pRANTES混合質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)招募炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況結(jié)果顯示，pFlt3L、pRANTES和pFlt3L

14、/pRANTES混合質(zhì)粒，注射局部肌肉組織部位大量炎性細(xì)胞聚集，而PBS、pcDNA3.1/V5-His注射局部未見明顯細(xì)胞浸潤(rùn)。說(shuō)明pFlt3L、pRANTES單獨(dú)或混合在一起均可在體內(nèi)獲得有效表達(dá)，并表現(xiàn)出生物學(xué)活性。 2.Flt3L與RANTES細(xì)胞因子佐劑對(duì)DNA疫苗抗原特異性免疫應(yīng)答的促進(jìn)作用pFlt3L和pRANTES聯(lián)合使用可顯著促進(jìn)小鼠脾臟特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，刺激指數(shù)SI為1.222±0.068(P<0.05

15、)；小鼠脾臟中高表達(dá)IFN-γ的CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)在F、R和F/R組中，分別是3.35±0.81％、1.72±0.50％、7.71±1.04％，與對(duì)照組比均有顯著差異(P<0.05或P<0.01)；而IL-4表達(dá)水平在各組無(wú)顯著區(qū)別(P>0.05)；小鼠脾細(xì)胞特異性CTL活性檢測(cè)中，當(dāng)效靶比為50:1時(shí)，F(xiàn)lt3L/RANTES組顯著高于其他各組(均P<0.05)。 3.Flt3L及RANTES對(duì)Prime-boost免疫策略

16、中抗原特異性免疫應(yīng)答的增強(qiáng)及抗腫瘤作用真核表達(dá)載體pFlt3L及pRANTES與核酸疫苗聯(lián)合免疫小鼠后，腫瘤細(xì)胞接種17天后，佐劑聯(lián)合DNA疫苗免疫經(jīng)蛋白加強(qiáng)組(DDS/Adj組)瘤體積最小，為888.5mm3，與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05)，佐劑聯(lián)合DNA疫苗免疫組(DDD/Adj組)及DDS/Adj組均可顯著促進(jìn)特異性淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(P<0.05)，且DDS/Adj組淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)顯著高于DDD/Adj組(P<0.05)

17、；與對(duì)照組比，各組小鼠脾臟高表達(dá)IFN-γ的CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.01)，IL-2表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)，但I(xiàn)L-4表達(dá)水平在各組無(wú)顯著區(qū)別(P>0.05)；DDD/Adj及DDS/Adj組小鼠脾細(xì)胞抗原特異性CTL活性顯著高于對(duì)照組(P<0.01或P<0.05)，且DDS/Adj組抗原特異性CTL活性顯著高于DDD/Adj組(P<0.05). 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pFlt3L、pR