一氧化氮誘導縫隙連接蛋白43在人眼和牛眼睫狀體表達的研究.pdf

1、縫隙連接(gap junction,GJ)為溝通相鄰細胞胞質的胞間通道,其在細胞膜上緊密聚集成簇,通過介導細胞間縫隙連接通訊(gap junctional intercellularcommunication,GJIC)參與胞間物質、能量的交換和信息的傳遞,因而對細胞的生長、發(fā)育和分化,神經沖動的傳導以及內環(huán)境穩(wěn)定的維持具有重要作用。
　　 縫隙連接蛋白(Connexins,Cxs)為一類具有較高同源性的蛋白超家族,是構成GJ的

2、基本單位。在眼部,Cxs已被證實存在于角膜、晶狀體、虹膜、睫狀體、視網(wǎng)膜等多處。Connexin43作為主要的縫隙連接蛋白,在睫狀體中主要表達于雙層上皮細胞,而在睫狀肌和基質中則未見表達。鑒于Cx43特定的表達位置及其功能上的重要性,越來越多的研究者開始關注其與房水生成之間的聯(lián)系,并圍繞Cx43的磷酸化調控,以及Cx43與房水生成相關機制進行了一些列相關研究。
　　 在眼部,一氧化氮合酶(nitric oxide synthas

3、e,NOS)含量豐富,其催化生成的一氧化氮(nitric oxide,NO)作為一種活躍的信號分子,可以通過激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)與鳥苷酸環(huán)化酶(guanylyl cyclase,GC)來增強細胞內第二信使環(huán)磷酸腺苷(adenosine3’,5’-cyclic monophosphate)和環(huán)磷酸烏苷(guanosine3’,5’-cyclic monophosphate,cGMP)的表達。后者作為

4、細胞間重要的第二信使在調控Cx43表達和通道功能上起重要作用,且一些藥物能夠加強或者減弱該作用。眼內可能存在多種信號通路,通過調節(jié)Cx43的表達和通道功能而影響房水生成過程。
　　 本研究旨在研究縫隙連接蛋白Cx43在離體人眼和牛眼睫狀體的表達與分布,以及No對其表達的調控作用,我們目前的研究結果提示NO作為一種有效的刺激物能夠促進睫狀體雙層上皮細胞間Cx43的表達,并且進一步證實了NO的該種作用主要依賴于其下游的cGMP/PK

5、G及cAMP/PKA信號通路的激活。本研究對進一步研究房水生成分子機制,了解某些抗青光眼藥物的降眼壓機制具有重要意義。具體包括:
　　 第一部分
　　 一氧化氮合酶和鳥苷酸環(huán)化酶在人眼睫狀體和小梁網(wǎng)中的表達及分布的研究
　　 [研究目的]
　　 研究神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOs),誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxid

6、e synthase,iNOS),內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及鳥苷酸環(huán)化酶(guanylyl cyclase,GC)在人眼睫狀體和小梁網(wǎng)的表達與分布。
　　 [材料和方法]
　　 收集10例眼外傷后48小時內摘除的病人眼球(排除其他眼部病史),常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色光鏡下觀察。切片脫色素后以免疫組織化學Envision二步法檢測nNOs、iNO

7、s、eNOs及GC在睫狀體中和小梁網(wǎng)中的表達,以磷酸緩沖液(PBS)代替上述各種一抗作為陰性對照。光鏡下讀片以顯色強度和陽性細胞密度相結合作為定性指標。
　　 [研究結果]
　　 三種一氧化氮合酶(NOS)及鳥苷酸環(huán)化酶(GC)在離體人眼睫狀體上皮、睫狀肌、小梁網(wǎng)和Schlemm's管內皮中均有廣泛表達。在睫狀體中,nNOS表達較強,主要表達在色素上皮(PE)和非色素(NPE)上皮細胞胞漿的頂端交界處。iNOS及eNOs

8、在PE與NPE兩種上皮細胞胞漿內均勻表達。在部分睫狀突中,GC在PE和NPE細胞胞漿中均勻分布,而在其他睫狀突中,GC在PE和NPE細胞胞漿頂端交界處表達較強。
　　 [研究結論]
　　 三種NOS亞型及GC在離體人眼睫狀體上皮、睫狀肌、小梁網(wǎng)和Schlemm's管內皮中均有廣泛表達。nNOS和GC的特定表達模式提示NO/cGMP信號通路其可能參與了人眼睫狀體跨上皮細胞間離子轉運,因而可能參與了房水生成的調節(jié)一過程。

9、r>　　 第二部分縫隙連接蛋白connexin43及connexin40在離體人眼和牛眼睫狀體中的表達
　　 [研究目的]
　　 研究兩種常見的縫隙連接蛋白即縫隙連接蛋白43(Connexin43,Cx43)和縫隙連接蛋白40(connexin40,Cx40)在正常人眼和牛眼睫狀體的表達及分布。
　　 [材料和方法]
　　 收集10例眼外傷后48小時內摘除的病人眼球(排除其他眼部病史)和10例當?shù)赝涝讏?/p>

10、新鮮摘取的牛眼球(排除眼球破裂和眼內炎眼球),常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色光鏡下觀察。切片脫色素后以免疫組織化學EnVision二步法檢測Cx43和Cx40在離體人眼睫狀體中的表達,以及Cx40在離體牛眼睫狀體的表達。以磷酸緩沖液(PBS)代替上述各種一抗作為陰性對照。光鏡下讀片以顯色強度和陽性細胞密度相結合作為定性的指標。
　　 [研究結果]
　　 Cx43在離體人眼及牛眼睫狀體中均存在基礎表達。其陽性染色密集分布于色

11、素上皮(PE)和非色素(NPE)上皮細胞胞漿頂端交界處。部分見于PE細胞交界處與其胞漿內。Cx40在離體人眼睫狀體組織呈陰性表達。
　　 [研究結論]
　　 Cx43在離體人眼和牛眼睫狀體上皮的分布模式,Cx43通道可能作為人眼和牛眼睫狀體上皮細胞間主要的縫隙連接通道來參與房水生成。
　　 第三部分NO-cGMP/cAMP信號通路對人眼與牛眼睫狀體Connexin43表達影響的研究
　　 [研究目的]

12、r>　　 研究一氧化氮(Nitric Oxide,NO)及其下游信號分子環(huán)磷酸腺苷(Adenosine3’,5’-cyclic monophosphate,cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(Guanosine3’,5’-cyclicmonophosphate,cGMP)對離體人眼和牛眼睫狀體縫隙連接蛋白43(Connexin43,Cx43)表達的調控作用及可能機制。
　　 [材料和方法]
　　 蛋白印跡(Westem blot)

13、法分別檢測離體人眼和牛眼睫狀體中Cx43蛋白的表達。將睫狀體組織分別與與NO供體硝普鈉(SNP,100μM)、cAMP替代物8-Bromo-cAMP(250pM)和cGMP替代物8-Bromo-cGMP(500μM)共同孵育18小時,并用上述藥物下游通道的抑制劑阻斷其效應,半定量分析對照組、SNP組、8-Bromo-cAMP組、8-Bromo-cGMP組和各抑制劑組Cx43蛋白表達的差異。
　　 [研究結果]
　　 蛋白

14、印跡法檢測到Cx43在離體人眼及牛眼睫狀體存在基礎表達。SNP,8-Bromo-cAMP,8-Bromo-cGMP能在18小時內顯著增加Cx43蛋白的基礎表達,PKA抑制劑H89在一定程度上抑制了SNP和82Bromo-cAMP對Cx43蛋白表達量的上調。PKG抑制劑KT5823在一定程度上能夠抑制SNP和8-Bromo-cGMP對Cx43蛋白表達量的上調,sGC抑制劑ODQ在一定程度上可抑制SNP對Cx43蛋白表達量的上調。