HDAC1特異性抑制Runx2介導的OPN的轉(zhuǎn)錄活性.pdf

1、Runx2是成骨細胞分化過程中的關鍵轉(zhuǎn)錄因子之一。Runx2在誘導干細胞向成骨細胞分化過程中需要依賴染色質(zhì)結構的變化和輔助因子的參與來調(diào)控Runx2與DNA的結合和Runx2的轉(zhuǎn)錄活性的改變。例如，抑制一種組蛋白去乙酰化酶HDAC3的活性可以顯著增強骨鈣蛋白基因表達、加速礦化。
　　在前人關于HDACs與Runx2的相互作用的研究成果的基礎上，進一步研究了HDAC1對Runx2介導的OPN的基因表達調(diào)控的影響。首先，通過熒光雙報告

2、檢測實驗檢測了HDAC家族成員HDAC1，3，4，5，6，7，8，10，Sirt2以及HAT家族成員P300，GCN5，CBP對Runx2介導的OPN啟動子活性的影響。結果發(fā)現(xiàn)，只有HDAC1和HDAC3對Runx2介導的OPN啟動子活性有明顯抑制作用;加入HDAC抑制劑TSA后，不僅這種抑制作用消失，反而加強了Runx2介導的OPN啟動子活性，而且顯著地抑制了HDAC1對Runx2介導的OPN啟動子活性的抑制作用。為了分辨核小體結構是

3、否參與HDAC1的這種抑制作用，把OPN啟動子連在能產(chǎn)生核小體結構的質(zhì)粒載體上，并同HDAC1、Runx2轉(zhuǎn)入細胞中。結果表明產(chǎn)生核小體的載體與不產(chǎn)生核小體的載體相比，HDAC1抑制Runx2介導的OPN啟動子活性的作用趨勢是基本相同的，而且TSA的作用效果也是基本相同的。這說明HDAC1對Runx2介導的OPN啟動子活性的影響與染色質(zhì)結構沒有關系。
　　接下來，用免疫熒光(IF）和免疫共沉淀(Co-IP)實驗，驗證了HDAC1與

4、Runx2共定位于細胞核中，猜測二者可能在同一復合物中。進一步用CHIP實驗證實，HDAC1和Runx2都能結合到OPN的啟動子上。通過將HDAC1瞬時轉(zhuǎn)染到過表達Runx2的細胞株中發(fā)現(xiàn)，HDAC1顯著抑制了Runx2誘導的OPN mRNA水平，但有趣的是，HDAC1對ALP mRNA水平?jīng)]有影響。在HDAC1的酶活性被TSA抑制后，Runx2誘導的OPN mRNA水平明顯上升，但同時Runx2誘導的ALP mRNA水平不變。這些結果

5、說明HDAC1抑制Runx2誘導的OPN mRNA水平的作用和HDAC1抑制Runx2激活OPN啟動子活性的作用是一致的，并且這種作用具有一定的特異性。
　　免疫印跡結果顯示，在誘導成骨細胞分化的第6天后，細胞中OPN的mRNA水平明顯提高，與此同時HDAC1蛋白水平減弱。不僅如此，還同時分析了多種不同細胞系的HDAC1蛋白水平，發(fā)現(xiàn)隨著分化程度的不斷深入，其HDAC1蛋白水平也呈逐步減弱的趨勢。以上結果表明，在Runx2上調(diào)OP

6、N mRNA的水平甚至在Runx2誘導成骨細胞分化的過程中，HDAC1可能起到一種抑制性的屏障作用，當Runx2通過了這個屏障后，HDAC1就不會再對OPN的表達起到明顯抑制作用，從而促進Runx2的調(diào)控作用。另外，還發(fā)現(xiàn)HDAC1對Runx2的蛋白水平?jīng)]有影響，而Runx2的蛋白水平卻隨著分化而明顯增加，因此猜測在成骨細胞分化過程中，可能存在HDAC1以外的某種表觀遺傳調(diào)控機制調(diào)控Runx2的蛋白質(zhì)水平，從而影響成骨細胞分化。研究初步