甲型血友病的基因診斷方法研究.pdf

1、目的:血友病(hemophilia)是一種常見的出血性疾病，主要是由于凝血活酶缺失導(dǎo)致，其中最為常見的是甲型血友病(Hemophilia A，HA)。甲型血友病是一種X連鎖的隱性遺傳病，約占先天性出血性疾病的85％，在男性活嬰的發(fā)病率約為1/5000，女性主要為攜帶者，患者少見。編碼凝血因子Ⅷ的基因發(fā)生突變而導(dǎo)致的該凝血因子功能缺陷或含量不足是該病發(fā)生的主要原因。臨床表現(xiàn)為自幼反復(fù)自發(fā)或輕微創(chuàng)傷后全身各部的出血，除皮膚、粘膜出血外，以肌

2、肉、關(guān)節(jié)出血為特點(diǎn)，反復(fù)關(guān)節(jié)出血往往導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，重要臟器出血甚至可危及生命。HA的發(fā)病輕重主要與FⅧ活性大小有關(guān)，F(xiàn)Ⅷ活性＜1％為重型，F(xiàn)Ⅷ活性在1％到5％之間為中型，5％到25％之間為輕型，還有一部分定義為亞臨床型，其FⅧ活性在25％到45％之間。目前只能靠替代療法、對(duì)癥處理等來維持患者的生命，臨床上沒有找到有效的根治性治療措施，因此對(duì)有生育要求的可疑攜帶者進(jìn)行基因診斷，篩查出攜帶者進(jìn)行產(chǎn)前診斷，從而降低血友病患兒的出生率是目前針對(duì)

3、HA最行之有效的辦法。通過產(chǎn)前診斷對(duì)胎兒進(jìn)行甲型血友病的診斷，主要是在風(fēng)險(xiǎn)胎兒的性別診斷的前提下，對(duì)男性胎兒進(jìn)行基因診斷，對(duì)女性胎兒進(jìn)行攜帶者基因的診斷。對(duì)臍帶血的凝血因子FⅧ抗原缺乏的測(cè)定也可以作為對(duì)高危胎兒的篩查方法，但是目前該方法還有待研究，不能作為確診依據(jù)。研究證實(shí)，內(nèi)含子22倒位是導(dǎo)致重型甲型血友病的一種重要的突變類型，其中，約有近30％～40％的重型HA是由內(nèi)含子22倒位引起，而內(nèi)含子1倒位作為近年來發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致重型HA的另一

4、個(gè)突變熱點(diǎn)，也占到了重型HA的5％左右。通過基因診斷，先確定是否存在內(nèi)含子22倒位或者內(nèi)含子1倒位這兩種常見的導(dǎo)致HA的突變熱點(diǎn)，在排除這兩種倒位之后再進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，全面篩查FⅧ的全部基因序列，找到問題位點(diǎn)。
　　本次實(shí)驗(yàn)對(duì)甲型血友病患者進(jìn)行FⅧ活性測(cè)定(coagulation factorⅧactivity，F(xiàn)Ⅷ∶C)，確定是否屬于重型患者。對(duì)患者進(jìn)行FⅧ基因內(nèi)含子22倒位檢測(cè)及內(nèi)含子1倒位分析檢測(cè)。對(duì)存在內(nèi)含子22倒位的患者的

5、FⅧ基因進(jìn)行測(cè)序分析，探索是否存在其他突變。通過實(shí)驗(yàn)，找到針對(duì)甲型血友病的一套直接基因診斷方法，并分析這套方法的研究對(duì)HA控制的臨床意義。
　　方法:采用國際通用一期法對(duì)33例甲型血友病患者進(jìn)行FⅧ活性測(cè)定(coagulation factorⅧ activity，F(xiàn)Ⅷ∶C)，根據(jù)FⅧ∶C測(cè)定結(jié)果對(duì)所有患者進(jìn)行甲型血友病的分型。采用LD-PCR方法進(jìn)行FⅧ內(nèi)含子22倒位檢測(cè)，應(yīng)用凝膠成像技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，找到倒位患者，分析改

6、組患者的倒位發(fā)生率，期間對(duì)反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化;采用雙管多重PCR技術(shù)對(duì)其中重型HA患者進(jìn)行內(nèi)含子1倒位檢測(cè)，凝膠成像技術(shù)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子22倒位的患者應(yīng)用捕獲測(cè)序技術(shù)檢測(cè)是否存在其他突變類型。
　　結(jié)果:應(yīng)用一期法對(duì)33例甲型血友病患者進(jìn)行FⅧ活性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示該組患者的FⅧ活性均小于1％，根據(jù)臨床分型證實(shí)均為重型甲型血友病，重型HA的發(fā)生率在改組人群中為100％;通過LD-PCR技術(shù)檢測(cè)33例重型HA患者中

7、有13例存在Int22倒位，倒位的發(fā)生率為39.4％(13/33);通過多重PCR技術(shù)檢測(cè)33例重型HA患者中存在Int1倒位患者1人，發(fā)生率為3％(1/33);對(duì)LD-PCR技術(shù)檢測(cè)出的13例存在內(nèi)含子22倒位的患者進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)其它基因突變。
　　結(jié)論:血友病種類繁多，F(xiàn)Ⅷ活性檢測(cè)是目前確診甲型血友病的有效方法。內(nèi)含子22倒位和內(nèi)含子1倒位是現(xiàn)如今發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致重型HA的兩大重要發(fā)病機(jī)制?；蛟\斷最好是在通過FⅧ活性檢測(cè)確診