HIV-1生物性克隆病毒的分離與鑒定及蕨麻提取物體外抗HIV活性研究.pdf

1、目的:由于HIV-1本身具有快速?gòu)?fù)制及高突變率的特點(diǎn),在宿主的選擇壓力及藥物的選擇壓力下,HIV感染者體內(nèi)存在高度復(fù)雜多樣且動(dòng)態(tài)變化的病毒準(zhǔn)種。目前常用的病毒分離方法均為共培養(yǎng)法,此法分離得到的僅為個(gè)體內(nèi)準(zhǔn)種中一株或幾株優(yōu)勢(shì)毒株,一些相對(duì)弱勢(shì)株會(huì)丟失,不能得到完整的多樣的病毒描繪。目前國(guó)外學(xué)者已經(jīng)建立了通過(guò)有限稀釋共培養(yǎng)獲得生物性克隆HIV-1毒株的方法。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用有限稀釋共培養(yǎng)方法從我國(guó)艾滋病感染者體內(nèi)分離單克隆的HIV-1毒株,旨在

2、豐富及發(fā)展我國(guó)HIV的病毒分離方法,并通過(guò)分析生物克隆病毒感染、復(fù)制能力以及基因序列的變異,驗(yàn)證分離方法的正確性與可行性。
　　 迄今,被美國(guó)FDA批準(zhǔn)的抗艾滋病藥物有27種,只有5種藥物用于我國(guó)艾滋病患者免費(fèi)抗病毒治療,耐藥毒株的出現(xiàn)和藥物的毒副作用,導(dǎo)致艾滋病患者抗病毒治療失敗,因此尋找高效、低毒的抗HIV-1的藥物是當(dāng)前HIV治療中面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn),我國(guó)具有豐富的植物資源,中草藥在抗HIV中的應(yīng)用已有廣泛報(bào)道。通過(guò)研究藏藥

3、蕨麻提取物的抗HIV-1活性以及其對(duì)相應(yīng)細(xì)胞的毒性作用,為開(kāi)發(fā)我國(guó)自主產(chǎn)權(quán)的抗艾滋病藥物提供可能。
　　 方法:從新疆及北京HIV-1感染者中選擇治療人群和未治療人群作為樣本,通過(guò)有限梯度稀釋感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral bloodmononuclear cells,PBMCs)后進(jìn)行共培養(yǎng)的方法,根據(jù)分離陽(yáng)性率來(lái)選擇性地分離生物性克隆的HIV-1毒株;利用P24抗原檢測(cè)試劑盒定性的檢測(cè)病毒分離情況,同時(shí)定期定量

4、檢測(cè)病毒P24抗原的釋放,分析各生物性克隆的HIV毒株間感染及復(fù)制能力的差異,同時(shí)擴(kuò)增培養(yǎng)上清中HIV-1 V1-V5區(qū)基因,并測(cè)序分析,比較各生物性克隆的HIV毒株間氨基酸序列的差異及聯(lián)系,從而驗(yàn)證生物性克隆分離方法的可行性。
　　 藏藥蕨麻提取物由本科室提取,分別用TZM-b1、MT-4和PBMCs檢測(cè)提取物的毒性作用,對(duì)于TZM-b1和MT-4細(xì)胞系,分別采用CCK-8試劑及快速細(xì)胞分析儀(CASY-TT)檢測(cè)各濃度下細(xì)胞

5、的存活數(shù)量,對(duì)于PBMCs僅選用CCK-8法檢測(cè),并運(yùn)用Reed-muench法計(jì)算蕨麻提取物對(duì)于以上細(xì)胞的50％細(xì)胞毒性劑量(50％ cytotoxicity concentrations，CC50)。
　　 抗HIV-1活性實(shí)驗(yàn),分別在TZM-b1、MT-4細(xì)胞系和PBMCs進(jìn)行蕨麻提取物對(duì)HIV-1實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株(SF33)的抑制實(shí)驗(yàn),用100TCID50(50％Tissue culture infective dose50

6、％組織細(xì)胞感染劑量)感染細(xì)胞,同時(shí),蕨麻提取物以40,20,10,5,2.5,1.25μg/mL濃度加入細(xì)胞,分別在感染3天或7天后,利用熒光和HIV P24檢測(cè)試劑盒檢測(cè)病毒進(jìn)入細(xì)胞并復(fù)制狀況,并運(yùn)用Reed-muench法計(jì)算蕨麻提取物對(duì)SF33的半數(shù)抑制濃度(50％inhibitory concentration IC50)。并進(jìn)一步分析蕨麻提取物對(duì)于我國(guó)HIV-1臨床分離株和HIV假病毒的抑制作用。
　　 結(jié)果:1、運(yùn)用

7、有限稀釋共培養(yǎng)法,成功地從個(gè)體艾滋病患者PBMCs中分離出多株病毒,實(shí)現(xiàn)了微量HIV-1的分離。
　　 2、分離得到的系列病毒,在擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中,總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì),說(shuō)明采用此法分離的HIV毒株具有感染能力;在相同分離及復(fù)制條件下,各病毒在不同時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生的P24抗原含量存在差異,說(shuō)明個(gè)體內(nèi)各毒株的感染能力及復(fù)制能力具有差異。
　　 3、通過(guò)分析病人體內(nèi)毒株間env區(qū)中的V1-V5區(qū)的氨基酸序列,各生物性克隆HIV-1毒株間存

8、在氨基酸的變異、插入及缺失,從基因水平證實(shí)了準(zhǔn)種理論。
　　 4、采用CCK-8試劑檢測(cè)蕨麻提取物對(duì)PBMCs的(CC50)為92.5μg/mL,對(duì)TZM-b1細(xì)胞的CC50為147.5μg/mL,對(duì)MT-4上的CC50為163.4μg/mL,使用CASY方法檢測(cè)的蕨麻提取物對(duì)TZM-b1細(xì)胞的CC50為220μg/mL,對(duì)MT-4的CC50為.153.9μg/mL。
　　 5、蕨麻提取物在PBMCs和TZM-b1和MT

9、-4細(xì)胞上對(duì)SF33的IC50分別是IC50分別為和4.02μg/mL、4.67μg/mL和6.17μg/mL;對(duì)兩株我國(guó)臨床分離株的IC50平均為1.99μg/mL,對(duì)于4株HIV假病毒的平均IC50為2.43μg/mL。
　　 結(jié)論:1、采用有限稀釋、梯度稀釋病人PBMCs后共培養(yǎng)方法,根據(jù)各梯度下陽(yáng)性率,可在某稀釋度下分離得到由單個(gè)感染的細(xì)胞產(chǎn)生的HIV-1毒株,即生物性克隆的HIV-1毒株
　　 2、個(gè)體內(nèi)分離獲