穿山甲蛋白提取物對人白血病K562細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、[研究背景]
　　 慢性粒細(xì)胞白血?。–hronic myeloid leukemia，CML）是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一?；熑匀皇侵委煱籽〉闹饕侄?，其副作用及臨床耐藥已成為化療的主要障礙。酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine kinase inhibitors，TKI）的出現(xiàn)是內(nèi)科治療CML的新的里程碑，但是由于基因變異引起的耐藥現(xiàn)象也日見增多，因此尋找針對CMI更有效、毒副反應(yīng)更少的藥物是臨床治療迫切需要解決的問題之一

2、。
　　 傳統(tǒng)中藥治療腫瘤由來已久。現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腫瘤的病機多為“熱毒”、“瘀血”、“瘀毒”等，從近幾十年來所取得的成果來看，砷劑（雄黃）、苦參堿（苦參）、靛玉紅（青黛）等均作為“以毒攻毒”、“清熱解毒”、“活血化瘀”的藥物而被應(yīng)用于中醫(yī)臨床，并取得顯著療效。目前，用現(xiàn)代化的科學(xué)技術(shù)，對傳統(tǒng)中草藥進(jìn)行大力開發(fā)，對其藥理學(xué)作用給予新的理解和闡述，致力于研究開發(fā)出新的抗癌藥物，來大力弘揚祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，已成為當(dāng)前中醫(yī)藥研究的發(fā)展趨勢。

3、
　　 現(xiàn)代研究證實中藥治療白血病的作用可表現(xiàn)在以下幾方面：直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，一定程度逆轉(zhuǎn)白血病多藥耐藥，增加患者免疫力，減輕化療副作用等。白血病與凋亡關(guān)系密切，利用凋亡機制清除白血病細(xì)胞引發(fā)出白血病治療的新觀念、新手段。中藥可通過多種途徑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，包括直接殺傷、細(xì)胞周期阻滯、影響凋亡基因表達(dá)、誘導(dǎo)分化、提高細(xì)胞因子及體內(nèi)激素水平等。
　　 現(xiàn)代藥理研究表明穿山甲對腫瘤的影響包括一定程度抑制腫瘤生長，使T細(xì)胞亞

4、群、NK細(xì)胞活性增高，提高晚期癌癥患者生存質(zhì)量及免疫功能，減少患者惡心嘔吐、白細(xì)胞減少、血小板減少等化療副作用。臨床研究用于治療肺癌、乳腺癌、白血病等惡性腫瘤均有報道。但臨床使用穿山甲時，多與其他中藥配伍使用，單用或提取成分應(yīng)用較少，而且對慢性粒細(xì)胞白血病的作用及作用機制的報道目前仍未見。本研究進(jìn)一步驗證穿山甲蛋白提取物的體外抗白血病療效，為穿山甲的臨床使用奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 [研究目的]
　　 為進(jìn)一步驗證穿山甲對白

5、血病的抗腫瘤作用，以慢性髓細(xì)胞性白血病K562細(xì)胞株為研究對象，觀察穿山甲蛋白提取物對K562細(xì)胞的生長增殖及凋亡的影響，探討穿山甲誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡可能的作用機制。
　　 [研究方法]
　　 1.采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測K562細(xì)胞增殖。
　　 2.Hoechst33258熒光染色法觀察K562細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化。
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測K562細(xì)胞的凋亡率，驗證穿山甲蛋白提取物誘導(dǎo)K56

6、2細(xì)胞凋亡的作用。
　　 [研究結(jié)果]
　　 1.MTT實驗觀察穿山甲蛋白提取物對K562細(xì)胞生長及增殖的影響各濃度穿山甲蛋白提取物對K562細(xì)胞的增殖有不同程度的抑制作用，與空白對照組比較有顯著性差異（P<0.01），且在一定劑量范圍內(nèi)，隨穿山甲蛋白提取物濃度的增加，其抑制率越來越高，具有明顯的劑量依賴性；24小時IC50是12.07ug/ml；提取液本身有一定促凋亡作用，但與一定濃度穿山甲蛋白提取物相比，差異有統(tǒng)計學(xué)

7、意義（P<0.05）。
　　 2.Hoechst33258熒光染色法觀察K562細(xì)胞的形態(tài)變化
　　 20μg/ml劑量的穿山甲蛋白提取物作用K562細(xì)胞48 h后在鏡下可見細(xì)胞皺縮、變形，染色質(zhì)凝聚且邊緣化，部分細(xì)胞體積變小并呈現(xiàn)DNA熒光碎片或出現(xiàn)濃染致密的塊狀和顆粒狀強熒光。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡
　　 Annexin V-PI雙染色法檢測結(jié)果顯示未加藥組、單純提取液組、穿山甲蛋白提取物

8、組48小時凋亡率分別是（3.42±0.69）％、（35.32±1.45）％、（49.04±1.84）％，穿山甲蛋白提取物組凋亡率高于陰性對照組和單純提取液組（P<0.05）。穿山甲蛋白提取物組與單純提取液組的壞死率無顯著差異。
　　 [結(jié)論]
　　 1.不同濃度穿山甲蛋白提取物能夠不同程度抑制K562細(xì)胞增殖，并且抑制率呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　 2.Hoechst33258熒光染色法顯示穿山甲蛋白提取物能夠