5-HETE引起人白血病K562細(xì)胞凋亡及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、研究主要從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞半定量及5-HETE對K562細(xì)胞損傷中細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡基因改變等方面,考察了5-HETE對K562細(xì)胞引起的凋亡作用;觀察5-HETE引起凋亡作用時(shí)K562細(xì)胞對酪氨酸磷酸化、MAPK途徑中ERK磷酸化及P38 MAPK磷酸化等的變化;并應(yīng)用酶氨酸蛋白激酶抑制劑genestein、P38 MAPK抑制劑SB2035809和MEK抑制劑PD098059觀察5-HETE對K562細(xì)胞在磷酸化途徑及MAPK

2、途徑上的作用,試圖闡明5-HETE通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制.該研究主要結(jié)果如下:1.5-HETE引起白血病K562細(xì)胞的凋亡:1.1采用四唑鹽比色法測定5-HETE對K562細(xì)胞損傷時(shí)間在3h~24h之間、濃度在0.1~0.5μM、損傷時(shí)間為12h時(shí)能引起K562細(xì)胞損傷.1.2電鏡觀察損傷的形態(tài)學(xué)改變:與無5-HETE處理組對照,在5-HETE刺激下,K562呈現(xiàn)出典型的凋亡特征:細(xì)胞表面微絨毛消失,細(xì)胞質(zhì)濃

3、縮,細(xì)胞核變小,核染色質(zhì)濃縮并凝結(jié)成塊,出現(xiàn)染色質(zhì)質(zhì)沿核膜內(nèi)側(cè)排列的核著邊現(xiàn)象,呈半月形凝集在核膜周邊.1.3利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn),對照組細(xì)胞凋亡率為6％,而5-HETE損傷組的細(xì)胞凋亡率上升到22％,與對照組相比有顯著性差異.1.4RT-PCR分析5-HETE引起K562細(xì)胞凋亡時(shí),細(xì)胞內(nèi)促凋亡基因和抗凋亡基因的改變.2.5-HETE引起K562細(xì)胞凋亡的MAPK途徑研究:2.1 5-HETE對酪氨酸磷酸化的作用:與空白相比

4、,在加入5-HETE 1min、5min、10min、30minT 60min時(shí),酪氨酸磷酸蛋白的表達(dá)在1min~10min呈時(shí)間依賴性地減少,在10min時(shí)達(dá)到最低;2.2 5-HETE對ERK磷酸化的作用:在加入5-HETE 1min、5min、10min、30minT 60min時(shí),ERK磷酸化蛋白的表達(dá)呈時(shí)間依賴性地減少;在ERK磷酸化的長時(shí)間作用中,5-HETE損傷組在24h時(shí)蛋白的表達(dá)量最低;2.3 5-HETE對P38磷酸

5、化的作用:與空白組相比,在加入5-HETE 1min、5min、10min、30minT 60min時(shí),30min蛋白的表達(dá)量最低;3.應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑genestein、P38 MAPK抑制劑SB2035809和MEK抑制劑PD098059,分別觀察對5-HETE引起K562凋亡作用的影響:3.1 5-HETE損傷組引起K562細(xì)胞細(xì)胞色素C釋放增加、caspase 3、8和釋放增加;3.2 應(yīng)用P38 MAPK 抑制劑SB203

6、580時(shí),與5-HETE損傷組相比,抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)增加、caspase家族中caspase3和caspase9的表達(dá)減少;3.3 應(yīng)用MEK抑制劑PD098059,與5-HETE損傷組相比,抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)增加,caspase3的表達(dá)沒有顯著差異.3.4 應(yīng)用酪氨激酶抑制劑genstein的處理組中,細(xì)胞色素C的釋放與5-HETE損傷組相比顯著減少caspase3、caspase8和caspase9的表達(dá)與5-HE

7、TE損傷組沒有顯著性差異.3.5 三種抑制劑能分別對抗5-HETE引起的K562細(xì)胞存活率的降低;以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:5-HETE在白血病K562細(xì)胞的凋亡中起著重要作用.根據(jù)這些結(jié)果,我們認(rèn)為5-HETE通過減少酪氨酸磷酸化及MAPK途徑中P38磷酸化、ERK磷酸化作用,激活細(xì)胞色素C自線粒體釋放至胞質(zhì),促使胞質(zhì)細(xì)胞色素C對caspase蛋白酶的激活從而導(dǎo)致K562細(xì)胞凋亡.作為酪氨酸激酶抑制劑的genestein、P38 MAPK抑制