空心菜根結(jié)巨型細(xì)胞凋亡的組織病理學(xué)研究.pdf

1、植物根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)是植物寄生線蟲的重要類群之一，由于其寄主范圍廣且危害嚴(yán)重，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)根結(jié)線蟲二齡幼蟲侵染寄主植物根系后，食道腺分泌蛋白經(jīng)口針注入到侵染位點(diǎn)，誘導(dǎo)寄主植物維管組織細(xì)胞重新分化成巨型細(xì)胞并產(chǎn)生瘤狀的根結(jié)，其口針源源不斷的吸食寄主植物營養(yǎng)，因此嚴(yán)重影響寄主植物的生長發(fā)育。目前對(duì)根結(jié)線蟲的防治主要采用傳統(tǒng)的方法，防治較為困難。隨著分子生物學(xué)的日趨成熟，通過分子生物學(xué)技術(shù)深入

2、研究根結(jié)線蟲與其寄主植物巨型細(xì)胞的分子互作機(jī)理，培育新型的轉(zhuǎn)基因抗線蟲作物，從根本上切斷根結(jié)線蟲的侵染途徑從而對(duì)根結(jié)線蟲進(jìn)行防治成為一個(gè)新方向，因此了解巨型細(xì)胞的發(fā)育過程至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)在根結(jié)線蟲侵染寄主植物后期，巨型細(xì)胞出現(xiàn)明顯的空洞化和內(nèi)含物大幅降低，但空洞化的具體過程尚不清楚?？招牟耸且环N理想的根結(jié)線蟲寄主植物，本研究以空心菜為對(duì)象對(duì)巨型細(xì)胞進(jìn)行研究，為揭示根結(jié)線蟲調(diào)控其寄主巨型細(xì)胞空泡化的過程打下基礎(chǔ)。主要取得以下創(chuàng)新性結(jié)果

3、：
　　1、優(yōu)化了石蠟切片技術(shù)。根據(jù)空心菜根結(jié)組織幼嫩且含水量高的特點(diǎn)，改變石蠟切片染色方法，即由傳統(tǒng)的脫蠟后染色轉(zhuǎn)變?yōu)楦Y(jié)組織的整體染色，并采用橫切的切片方式，最終得到的橫切整體染色圖中,各組織著色效果良好且結(jié)構(gòu)清晰，巨型細(xì)胞、根結(jié)線蟲及巨型細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核清晰可見。
　　2、利用優(yōu)化后的石蠟切片技術(shù)，首次揭示了空心菜根結(jié)內(nèi)巨型細(xì)胞及其內(nèi)含物的發(fā)育過程。2齡幼蟲侵入寄主后，巨型細(xì)胞及其內(nèi)含物的面積和直徑變化趨勢(shì)相同，首先逐步增

4、大，在27 d時(shí)首次達(dá)到峰值，面積分別為26917.4±314.7μm2和22302.5±376.2μm2，直徑分別為276.5±6.2μm和254.5±7.7μm；之后逐步減小，在32 d時(shí)首次達(dá)到谷值，面積分別為8677.9±170.6μm2和7902.7±113.0μm2，直徑分別為185.5±5.1μm和151.0±6.5μm；在43 d時(shí)再次達(dá)到峰值，面積分別為28319.8±331.9μm2和18619.3±331.2μm2

5、，直徑分別為393.0±5.5μm和332.5±3.1μm。巨型細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核數(shù)量首先逐步增加，在23 d時(shí)達(dá)到峰值27.6±2.2個(gè)后逐步減少，32 d時(shí)達(dá)到谷值9.8±0.9個(gè)后，又逐步增加，43 d時(shí)再次達(dá)到峰值29±1.0個(gè)。巨型細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核面積首先逐步增大，在32 d時(shí)達(dá)到峰值163.7±4.6μm2后，逐步減小，41 d時(shí)達(dá)到谷值106.2±2.9μm2。這些結(jié)果綜合表明根結(jié)線蟲成熟后期巨型細(xì)胞發(fā)生凋亡，并在32 d達(dá)到最大限

6、度凋亡。
　　3、揭示了空心菜根結(jié)巨型細(xì)胞的凋亡特征。對(duì)根結(jié)線蟲侵染后期的巨型細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，巨型細(xì)胞皺縮，細(xì)胞壁增厚，內(nèi)含物變少，巨型細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核膨大且數(shù)量較少。利用優(yōu)化后的TUNEL技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞水平上的凋亡檢測(cè)，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照中巨型細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核沒有明顯的綠色熒光信號(hào)出現(xiàn)，而陽性對(duì)照和處理組中巨型細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核出現(xiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光信號(hào)。以上結(jié)果表明，根結(jié)線蟲侵染寄主植物后期巨型細(xì)胞產(chǎn)生凋亡現(xiàn)象。
　　4、利用免疫熒光技

7、術(shù)在空心菜根結(jié)組織對(duì)根結(jié)線蟲MiPDCD6蛋白進(jìn)行了定位。收集根結(jié)線蟲侵染第8 d、31 d和32 d的空心菜根結(jié)部位，制作石蠟切片，然后進(jìn)行根結(jié)線蟲MiPDCD6蛋白在寄主植物根結(jié)組織的熒光免疫定位，在ZEISS LSCM780激光掃描共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。結(jié)果顯示，侵染第8d的根結(jié)切片中巨型細(xì)胞內(nèi)零星散落著些許綠色熒光顆粒；侵染第31 d和第32 d的根結(jié)切片中根結(jié)線蟲體內(nèi)及口針附近有較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)，巨型細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)少許綠