急性白血病骨髓基質(zhì)GJIC變化及其機(jī)制的研究.pdf

1、造血微環(huán)境(hematopoietic inductive microenvironment，HIM)是造血干/祖細(xì)胞定殖、分化、發(fā)育和成熟的場(chǎng)所，造血基質(zhì)細(xì)胞是造血微環(huán)境的主要成分。造血基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)與造血實(shí)質(zhì)細(xì)胞密切接觸、分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和多種造血生長(zhǎng)因子(hematopoietic growth factor，HGF)來(lái)調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的自我更新、增殖和分化過(guò)程，以保證機(jī)體造血功能的正常

2、進(jìn)行。關(guān)于造血功能損傷與修復(fù)的研究與應(yīng)用，既往多側(cè)重于造血實(shí)質(zhì)細(xì)胞，對(duì)構(gòu)成造血微環(huán)境重要成分的造血基質(zhì)細(xì)胞的研究尚需進(jìn)一步深入。 間隙連接細(xì)胞間通訊(gap iunction intercellular communication，GJIC)是相鄰細(xì)胞之間信號(hào)傳遞的主要方式，GJIC的物質(zhì)基礎(chǔ)是相鄰細(xì)胞膜上連接子偶聯(lián)形成的通訊通道，由連接蛋白(Connexin，Cx)組成，在造血組織中主要是Cx413。近期國(guó)內(nèi)外研究表明， Cx

3、413介導(dǎo)的GJIC是骨髓基質(zhì)細(xì)胞調(diào)控造血的必要條件。急性白血病作為一種常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其骨髓基質(zhì)細(xì)胞上Cx43蛋白的表達(dá)以及GJIC功能和正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞比較是否存在差異?GJIC功能的差異是否會(huì)影響基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特性及支持造血的能力?是否可以通過(guò)藥物等外源性介質(zhì)改變白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞Cx413的表達(dá)及GJIC的功能?目前尚未見相關(guān)研究發(fā)表。結(jié)合科室研究方向，本實(shí)驗(yàn)對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行探討。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1．通過(guò)免疫

4、細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦掃瞄顯微鏡及RT-PCR等方法在不同水平上檢測(cè)初發(fā)急性白血病、正常及化療后完全緩解的急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞上Cx43的表達(dá)。結(jié)果顯示：(1)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞Cx43的表達(dá)陽(yáng)性率為(47.2±2.04)％，較正常(86.4±6.23)％及化療后完全緩解急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞(61.2±8.24)％明顯減低(p<0.01)，正常及急性白血病化療前、后骨髓基質(zhì)細(xì)胞上Cx43蛋白的平均光密

5、度值分別為121.0±16.28、48.3±11.69及93.3±14.38，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均<0.01)，并出現(xiàn)定位異常；(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞Cx4-3蛋白表達(dá)量為(38.75±23.95)％，與其它兩組((76.51±13.15)％和(71.98±7.5)％)間有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p值均<0.01)；(3)使用激光共聚焦掃瞄顯微鏡對(duì)正常、急性白血病以及急性白血病化療后完全緩解骨髓基質(zhì)細(xì)胞上Cx

6、43的定量結(jié)果顯示，其象素密度分別為：(81.04±8.84)％、(34.10±17.91)％和(70.33±4.90)％。 初發(fā)急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞上的Cx43含量明顯低于正常及化療后完全緩解的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(p<0.01)；(4)RT-PCR方法檢測(cè)三組實(shí)驗(yàn)樣本的基質(zhì)細(xì)胞上Cx43的mRNA，初發(fā)急性白血病組的表達(dá)能力明顯低于正常及化療后完全緩解的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(p<0.01)。通過(guò)染料傳輸實(shí)驗(yàn)及熒光漂白恢復(fù)技術(shù)比較發(fā)現(xiàn)急性白

7、血病骨髓基質(zhì)GJIC功能明顯減弱。其中，染料傳輸實(shí)驗(yàn)顯示，正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞上的LY熒光通過(guò)間隙連接傳輸至10個(gè)細(xì)胞以上，初發(fā)的急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞的熒光彌散至較近的1～2列細(xì)胞，化療后完全緩解的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間通訊功能較化療前明顯增強(qiáng)，LY熒光染色彌散4～5列細(xì)胞，白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞組與正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞組相比較差異顯著(p<0.01)，白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞組與化療后CR的骨髓基質(zhì)細(xì)胞組相比較差異顯著(p<0.01)；熒光漂白恢復(fù)技術(shù)

8、顯示，正常及完全緩解的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的最大恢復(fù)比例為(84.29±2.93)％和(78.94±2.46)％，平均熒光恢復(fù)速率分別為(19.20±1.39)％/min和(13.52±1.65)％/min，急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞的最大恢復(fù)比例為(38.30±2.95)％，平均熒光恢復(fù)速率為(5.58±1.00)％/min，與前兩組間有非常顯著性差異(p<0.01)。 2．應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦掃瞄顯微鏡及RT-PCR

9、等方法檢測(cè)初發(fā)急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞在全反式維甲酸及兩性霉素B作用下Cx43表達(dá)的變化，并通過(guò)染料傳輸實(shí)驗(yàn)及熒光漂白恢復(fù)技術(shù)比較其GJIC功能的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)ABMSCs-ATRA組Cx43表達(dá)的陽(yáng)性率和平均光密度值分別為(54.5±5.66)％和84.3±8.80，明顯高于ABMSCs組(p值均<0.01)；ABMSCs-AB組Cx43表達(dá)的陽(yáng)性率和平均光密度值分別為(45.3±3.26)％和45.8±4.1

10、5，和ABMSCs組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ABMSCs-ATRA組Cx43蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率為(49.5±5.46)％，明顯高于其余兩組(p值均<0.01)；ABMSCs組(38.75±23.95)％和ABMSCs-AB組(35.9±4.06)％之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。(3)激光共聚焦掃瞄顯微鏡檢測(cè)ABMSCs-ATRA組Cx43熒光的象素密度為(45.25±5.98)％，明顯高于其余兩組，存在非

11、常顯著性差異(p<0.01)；ABMSCs和ABMSCs-AB組Cx43熒光的象素密度分別為(34.10±17.91)％和(32.9±3.98)％，兩組數(shù)據(jù)之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。(4)RT-PCR方法檢測(cè)三組基質(zhì)細(xì)胞Cx43的mRNA，其中ABMSCs-ATRA組的表達(dá)量明顯高于其它兩組(p<0.01)。(5)染料傳輸實(shí)驗(yàn)顯示，ABMSCs-ATRA組上的LY可彌散至4～5個(gè)細(xì)胞，明顯高于ABMSCs組(p<0.01)，

12、ABMSCs-AB組未發(fā)生彌散，和ABMSCs組有非常顯著性差異(p<0.01)。(6)FRAP結(jié)果顯示，ABMSCs-ATRA組細(xì)胞的熒光最大恢復(fù)速率為(80.94±1.46)％，平均恢復(fù)速率為(15.03±1.27)％/min；和ABMSCs組間有非常顯著性差異(p<0.01)。ABMSCs-AB組基質(zhì)細(xì)胞上的熒光在淬滅后400秒內(nèi)無(wú)恢復(fù)。 3．觀察急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞在全反式維甲酸作用下引起的GJIC功能的改變及其導(dǎo)致的

13、生物學(xué)特點(diǎn)的變化。結(jié)果現(xiàn)示：全反式維甲酸所引起的GJIC功能上調(diào)可使急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞的(1)增殖減慢，增殖周期中S期細(xì)胞減少(29.5％→7.96％)，G<,0>/G<,1>期細(xì)胞比例增加(61.1％→77.2％)；(2)凋亡率增加(5.16±2.35％→9.78±4.88％)；(3)造血生長(zhǎng)因子GM-CSF分泌減少(10280.0±950→9260.0±123)，SCF分泌減少(1490.7±188→1327.1±118)；(4

14、)增強(qiáng)細(xì)胞外鈣離子的內(nèi)流(17.92±3.31nmoL/L→76.54±9.6nmoL/L)(p<0.01)。 結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)條件下，(1)急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞Cx43的含量較正常及化療后完全緩解急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞明顯減低且定位異常，其細(xì)胞間通訊功能明顯減弱；(2)全反式維甲酸可上調(diào)急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞Cx43的表達(dá)及GJIC的功能，兩性霉素B不影響急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞Cx43的表達(dá)但可以阻斷GJIC功能；(3)上調(diào)急