豬腺病毒的分離與鑒定.pdf

1、腺病毒載體是繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后在基因治療、基因免疫等方面應(yīng)用開發(fā)得較早且較成熟的一種基因載體。與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，腺病毒載體能高效地把外源基因轉(zhuǎn)運(yùn)到各種靶細(xì)胞和組織中，其作為真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體具有制備簡便、宿主范圍廣、感染性強(qiáng)、包裝容量大、病毒繁殖滴度高、安全性好等優(yōu)點(diǎn)。使用非人類腺病毒作為載體主要是因?yàn)樗虏⌒缘蜕踔翛]有致病性，而且動物腺病毒與人腺病毒具有相似的基因組結(jié)構(gòu)，目前不同的動物腺病毒已被開發(fā)作為腺病毒表達(dá)載體，如牛腺病毒

2、三型(BAd3)、犬腺病毒二型(CAd2)、黑猩猩腺病毒一型、綿羊腺病毒七型(OAd7)、豬腺病毒三型和五型(PAd3，PAd5)、禽腺病毒l，8，9和10型(FAdl，8，9，10)。在人的血清中不存在動物腺病毒中和抗體，說明動物腺病毒不在人群中流行，而且，預(yù)先存在于人和實(shí)驗(yàn)動物中的HAd5中和抗體不交叉中和動物腺病毒，此外，動物腺病毒能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)人和非人類細(xì)胞，因此，動物腺病毒作為載體用于人和獸醫(yī)將更為有效。 本研究根

3、據(jù)豬腺病毒保守區(qū)六鄰體基因設(shè)計(jì)兩對簡并引物，建立了nested PCR的檢測方法，對51份病豬的氣管分泌物作檢測，結(jié)果只有l(wèi)份是陽性。然而，我們用其中的13份陰性病料接種PK-15細(xì)胞，做病毒分離，結(jié)果傳到第二代時一份為nested PER陽性，傳到第三代時供有10份為nested PCR陽性，病毒分離陽性率為76.9％。其中有四份傳到第四代時引起細(xì)胞病變，細(xì)胞成葡萄串狀脫落，而且連續(xù)傳8代后都能穩(wěn)定地出現(xiàn)細(xì)胞病變，其余六份僅neste

4、d PCR陽性。這是國內(nèi)首次分離到的豬腺病毒。 對所分離到的病毒隨機(jī)抽取引起細(xì)胞病變的1份和不引起細(xì)胞病變的1份(分別命名為GXTL株和GXHP株)作nested PER擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出了341bp的特異性片段，經(jīng)克隆與測序，以及序列比較，發(fā)現(xiàn)GXTL株與豬腺病毒五型(PAV5)的同源性達(dá)97.4％，GXHP株與豬腺病毒三型(PAV3)的同源性達(dá)95.3％。 對GXTL株作TCID<,50>測定，其病毒滴度為10<'6