酸性肽、大豆黃酮和C肽對神經元內APP、NOS1及β-分泌酶表達的影響.pdf

1、背景和目的:阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是以進行性記憶和認知功能喪失為臨床特征的大腦退行性疾病,其神經病理學特征為神經細胞內神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)、神經細胞外則表現(xiàn)為老年斑(senile plaques,SPs)。有研究表明β-淀粉樣蛋白(Aβ)對膽堿能神經元的毒性是Alzheimer病的主要機制。因此對Aβ的產生、降解和清除的分子生物學研究是目前研究A

2、lzheimer病的熱點之一。近年來,一氧化氮(NO)在中樞神經系統(tǒng)中的病理生理作用成為神經科學研究的又一個熱點。NO是一種血管神經活性物質,具有調節(jié)腦血流、促進或抑制遞質釋放、參與突觸可塑性、神經元興奮毒性及炎癥性損害等多種作用,且與學習記憶有關,但過量的NO可通過過氧化應激、干擾腦內能量代謝使細胞內鈣調節(jié)紊亂等多種途徑而誘導細胞凋亡。大量實驗資料和臨床觀察表明,大腦海馬區(qū)與學習記憶有關。如果損傷海馬、穹窿、下丘腦乳頭體或乳頭體丘腦束

3、及其鄰近結構,可引起近期記憶功能的喪失。海馬細胞原代培養(yǎng)是研究神經細胞的重要手段之一。
　　本實驗原代培養(yǎng)海馬神經元,利用一氧化氮參與缺血缺氧損傷的病理生理過程的特點來誘導神經元為癡呆模型細胞。神經細胞之間信息傳遞方式需要通過神經遞質來實現(xiàn)。酸性肽是本實驗室分離出的一個小分子神經肽,它廣泛存在于動物的大腦中,參與多種功能的調節(jié)。它對老年性癡呆具有治療作用。大豆黃酮(soybean flavone),是一種類黃酮化合物。有研究證實大

4、豆黃酮可以提高抗氧化酶的活性,因而能提高機體的抗氧化能力。
　　本實驗通過大豆黃酮對癡呆模型的海馬神經元內一些蛋白質分子水平的作用研究,探討了其延緩腦老化的生物學機制。C肽是本實驗從動物體中分離的另一肽類化合物。本實驗初步研究了C肽和神經元凋亡之間的關系。
　　材料與方法:用新生24小時內的SD大鼠經解剖分離海馬,胰蛋白酶消化,獲得單細胞懸液,通過接種、換液等步驟,培養(yǎng)10-12天,生物性狀穩(wěn)定可用于實驗。以下是實驗的主要步

5、驟。1、解剖分離出海馬組織。2、培養(yǎng)到第10到11天的神經元進行神經特異性烯醇化酶(NSE)的免疫細胞化學染色鑒定,神經元純化率達95％以上時進行下列實驗。3、體外培養(yǎng)至10天的神經元用酸性肽、大豆黃酮、C肽分別以三種不同濃度預處理6小時,然后再加入終濃度為50umol/L的硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP)處理海馬神經元。實驗分為11組。Ⅰ組:正常對照組;Ⅱ組:SNP處理組;Ⅲ組:0.15mg/mL酸性肽+SN

6、P組;Ⅳ組:0.3mg/mL酸性肽+SNP組;Ⅴ組:0.6mg/mL酸性肽+SNP組;Ⅵ組:0.15mg/mL大豆黃酮+SNP組;Ⅶ組:0.3mg/mL大豆黃酮+SNP組;Ⅷ組:0.6mg/mL大豆黃酮+SNP組;Ⅸ組:0.15mg/mLC肽+SNP組;Ⅹ組:0.3mg/mLC肽L+SNP組;Ⅺ組:0.6mg/mLC肽+SNP組。以上11組細胞繼續(xù)培養(yǎng)至24小時進行以下實驗,做細胞的免疫細胞化學染色。通過德國Lecia顯微照相系統(tǒng)采集免

7、疫細胞化學染色后的圖片,然后經Biosens Digital ImagingSystem v1.6測定陽性區(qū)的灰度值,其中每張片至少選取5個視野,取均值。數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進行分析,顯著性檢驗采用單因素方差分析及秩和檢驗分析,以α=0.05作為有顯著性水準。
　　結果:1.成功建立了新生(24h)SD大鼠海馬神經元體外培養(yǎng)模型,并建立了SNP誘導的體外培養(yǎng)海馬神經元凋亡的模型。2.酸性肽、大豆黃酮、C肽能拮抗SNP的神經毒

8、性。細胞的免疫化學染色顯示酸性肽、大豆黃酮、C肽在實驗范圍內有劑量依賴關系。與對照組相比,SNP處理的海馬神經元的淀粉樣前體蛋白(amyloid precusor protein,APP)、β-分泌酶(β-secretase,BACE)、NO化氮合酶1(NO synzyme1,NOS1)的表達顯著增加(P<0.05);與SNP組相比,各濃度AP組、高濃度大豆黃酮組、各濃度C肽組的海馬神經元內APP、BACE、NOS1的表達明顯降低(P<