共振光散射光譜探針在DNA雜交及多態(tài)性檢測中的研究與應(yīng)用.pdf

1、DNA雜交及多態(tài)性檢測分析廣泛的應(yīng)用于病毒及遺傳疾病的診斷,已經(jīng)引起分子生物學(xué)、藥學(xué)、生物化學(xué)以及分析化學(xué)等領(lǐng)域工作者的高度關(guān)注。本論文在課題組多年研究的積累及大量文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上,合成了熒光高分子聚合物聚[5-甲氧基-2-(3-磺?；趸?-1,4-苯撐乙烯(MPS-PPV)作為共振光散射光譜探針,及采用三苯甲烷染料溴甲酚綠(BG),表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB),多環(huán)芳烴萘及金屬卟啉銅作為探針,結(jié)合多種光譜法和電鏡分析

2、,探討其作用機(jī)理,建立了5個能夠識別完全互補(bǔ)和堿基錯配的DNA的新方法,其方法對疾病診斷方面有潛在應(yīng)用價值;2個測定納克級核酸、蛋白質(zhì)的新方法,方法準(zhǔn)確度和靈敏度高,簡便、快速。
　　1)合成了水溶性熒光高分子聚合物MPS-PPV,采用1H-NMR,IR對聚合產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,研究了聚合產(chǎn)物的紫外吸收,熒光性質(zhì),并用掃描電鏡研究了聚合物的表面形態(tài)。將MPS-PPV應(yīng)用到雜交檢測,在pH7.2的生理Tris-HCl緩沖溶液中

3、,在40℃溫度時,雜交反應(yīng)30min,在460nm處產(chǎn)生最大RLS信號。研究了其RLS光譜,熒光光譜性質(zhì),反應(yīng)的電化學(xué)性質(zhì),探討了反應(yīng)機(jī)理,機(jī)理研究表明,MPS-PPV可以通過CTAB的橋梁作用與帶負(fù)電荷的雙鏈DNA(P1≈T1)發(fā)生靜電結(jié)合作用,這種作用減弱了Pl≈T1骨架上的負(fù)電荷,增強(qiáng)了其骨架的疏水性,最終誘導(dǎo)了MPS-PPV-CTAB和P1≈T1之間相互聚集,導(dǎo)致大的聚集體的形成,這種大的聚集體表現(xiàn)出強(qiáng)的RLS信號放大作用。通過

4、測定放大的RLS信號,完全互補(bǔ)和有堿基錯配的DNA序列能很容易地被檢測和識別。這種方法不需要對探針DNA和目標(biāo)DNA序列進(jìn)行標(biāo)記,實(shí)現(xiàn)了完全互補(bǔ)序列與單堿基錯配序列及非互補(bǔ)堿基序列的區(qū)分,建立了簡單、快速、免標(biāo)記的DNA雜交檢測方法,在疾病的診斷方面有潛在的應(yīng)用價值。
　　2)以MPS-PPV為DNA的RLS探針,研究了二者相互作用的機(jī)理和反應(yīng)的RLS光譜,熒光光譜,紫外光譜,原子力顯微鏡(AFM)特性,建立了納克級DNA測定的新

5、方法。在pH5.0的BR緩沖溶液中,MPS-PPV對脫氧核糖核酸與陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的共振光散射光譜有協(xié)同增強(qiáng)作用,在共振光散射波長為342nm處,發(fā)生較大的共振光散射信號。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,體系的△IRLS值與魚精DNA(fsDNA)在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)為0.9996,檢測限最低可達(dá)3.10ng/mL。機(jī)理研究表明,MPS-PPV、CTAB和DNA之間的結(jié)合以靜電作用為主,同時還有一定

6、的疏水作用和扦插作用。
　　3)以MPS-PPV為蛋白質(zhì)的RLS探針,研究了反應(yīng)的RLS光譜,熒光光譜,紫外光譜,原子力顯微鏡(AFM)特性,探討了二者相互作用的反應(yīng)機(jī)理,建立了納克級蛋白質(zhì)測定的新方法。在pH3.22的BR緩沖溶液中,MPS-PPV與蛋白質(zhì)通過靜電作用和疏水作用,在共振光306nm處發(fā)生較大的共振光散射信號,體系的△IRLS值與牛血清白蛋白(BSA)在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)為0.9991,檢測限最

7、低可達(dá)3.99ng/mL。
　　4)以三苯甲烷類染料溴甲酚綠作為雜交檢測探針,探討了其他不同種三苯甲烷類染料甲基紫,鉻天青,亮綠,二甲酚橙和堿性品紅與ssDNA,dsDNA的RLS光譜特征,并用Gaussian03計算了染料分子體積對其與DNA作用的影響。研究了溴甲酚綠與dsDNA作用的RLS光譜,熒光光譜性質(zhì),紫外光譜,AFM特性,探討了反應(yīng)機(jī)理,建立了完全互補(bǔ)序列與單堿基錯配序列及非互補(bǔ)堿基序列的區(qū)分方法。機(jī)理研究表明,BG與

8、P1≈T1之間一定存在溝槽作用,這種溝槽作用減弱了P1≈T1骨架上的負(fù)電荷,增強(qiáng)了其骨架的疏水性,最終誘導(dǎo)BG-P1≈T1之間相互聚集,從而引起聚集體的形成和強(qiáng)的RLS信號放大作用。
　　5)以表面活性劑CTAB作為雜交檢測探針,探討了其他不同表面活性劑,陽離子表面活性劑:十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltriethylammnonium bromide,CTAB)和溴化十六烷基吡啶(Cetylpyrinium bromide,C

9、PB);陰離子表面活性劑:十二烷基苯磺酸鈉(Sodium dodecylbenzene sulphonate,SDBS)和十二烷基磺酸鈉Sodium dodecyl sulphonate(SDS),非離子表面活性劑:曲拉通-100(Triton-100,TX-100)和吐溫-80(Tween-80,T-80)與sDNA,dsDNA的RLS光譜特征。研究了CTAB與dsDNA作用的RLS光譜,熒光光譜性質(zhì),紫外光譜,AFM特性,探討了反應(yīng)

10、機(jī)理,建立了完全互補(bǔ)序列與單堿基錯配序列及非互補(bǔ)堿基序列的區(qū)分方法。機(jī)理研究表明,CTAB與P1≈T1之間存在靜電作用與疏水作用的協(xié)同影響,誘導(dǎo)CTAB-P1≈T1聚集,從而引起聚集體的形成和強(qiáng)的RLS信號放大作用。
　　6)以多環(huán)芳烴萘作為雜交檢測探針,探討了其他多環(huán)芳烴蒽、熒蒽、芘、菲與sDNA,dsDNA的RLS光譜特征。研究了萘與dsDNA作用的RLS光譜,熒光光譜性質(zhì),紫外光譜,AFM特性,探討了反應(yīng)機(jī)理,建立了完全互補(bǔ)

11、序列與單堿基錯配序列及非互補(bǔ)堿基序列的區(qū)分方法。萘能和雙鏈DNA(P1≈T1)發(fā)生溝槽結(jié)合作用,這種結(jié)合作用依賴于DNA的G-C堿基序列和萘分子的大小。這種結(jié)合減小了P1≈T1骨架的負(fù)電荷,增強(qiáng)了其疏水性,從而誘導(dǎo)了萘-P1≈T1之間的疏水結(jié)合作用,導(dǎo)致大的聚集體的形成。這種大的聚集體表現(xiàn)出強(qiáng)的RLS信號放大作用,通過測定這種放大的RLS信號,能夠準(zhǔn)確、簡便、快速的檢測和識別完全互補(bǔ)和有堿基錯配的DNA序列。此方法不需要對探針DNA和目

12、標(biāo)DNA序列進(jìn)行標(biāo)記。在疾病的診斷方面有潛在的應(yīng)用價值。
　　7)以卟啉銅作為雜交檢測探針,探討了其他金屬卟啉鈷,卟啉鉻,卟啉鎂,卟啉鋅,卟啉鎳與sDNA,dsDNA的RLS光譜特征。研究了卟啉銅與dsDNA作用的RLS光譜,熒光光譜性質(zhì),紫外光譜,AFM特性,探討了反應(yīng)機(jī)理,實(shí)現(xiàn)了完全互補(bǔ)序列與單堿基錯配序列及非互補(bǔ)堿基序列的區(qū)分。機(jī)理研究表明,疏水型金屬卟啉Cu(Ⅱ)-TAOPP能和雙鏈DNA(P1≈T1)發(fā)生締合作用,導(dǎo)致大