IVF-ET患者卵泡液有效成分對(duì)NK細(xì)胞功能的影響.pdf

1、近年來，體外受精-胚胎移植(IVF-ET)及衍生輔助生殖技術(shù)在臨床和實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)域都取得了很大發(fā)展。在該技術(shù)的應(yīng)用中，人們對(duì)卵細(xì)胞在體內(nèi)的生存環(huán)境——卵泡液進(jìn)行了全面多方位的研究分析，以求為卵細(xì)胞的體外培養(yǎng)創(chuàng)造最適生長(zhǎng)條件，進(jìn)一步提高移植胚胎種植妊娠率。在超促排卵過程中由于注射大劑量的超促排卵藥物，患者體內(nèi)各種激素水平相應(yīng)升高，從而卵母細(xì)胞生長(zhǎng)的局部環(huán)境及整個(gè)機(jī)體內(nèi)環(huán)境都發(fā)生變化。卵泡液內(nèi)含有多種濃度不同的激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，直接影響

2、生殖細(xì)胞的增殖、細(xì)胞分裂能力、分裂數(shù)量和生存時(shí)間，并進(jìn)而影響胚胎生長(zhǎng)發(fā)育。卵泡液中的細(xì)胞因子的含量，激素水平的高低，與患者的年齡，卵巢對(duì)藥物的反應(yīng)性及儲(chǔ)備功能密切相關(guān)。NK細(xì)胞是一類具有自發(fā)的細(xì)胞毒活性的細(xì)胞，是一類非常重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，通過釋放淋巴因子對(duì)機(jī)體免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，無須抗原刺激即可介導(dǎo)抗腫瘤和抗病毒功能。NK細(xì)胞即是天然免疫的主要承擔(dān)者，又是獲得性細(xì)胞免疫的核心調(diào)節(jié)細(xì)胞，其生物學(xué)功能受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。近來研究發(fā)現(xiàn)卵巢內(nèi)

3、的一些細(xì)胞因子對(duì)NK細(xì)胞的活性有增強(qiáng)或抑制的作用，而且NK細(xì)胞可能與胚胎著床、發(fā)育以及胎盤的形成有關(guān)，但作用機(jī)制尚不清楚，特別是罕有從NK細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用的角度進(jìn)行研究的報(bào)告。本實(shí)驗(yàn)以30例IVF-ET患者的卵泡液為研究對(duì)象，通過檢測(cè)其對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響，為進(jìn)一步了解卵泡液的組成成分奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)材料和方法 卵泡液采集：隨機(jī)選擇在沈陽市婦嬰醫(yī)院生殖中心進(jìn)行IVF-ET治療的不孕癥患者，共30例。卵泡成熟時(shí)穿

4、刺取卵，留取第一管無明顯血染的卵泡液。以3 000 r/min離心20 min，取上清液分裝于冷凍管中，投入液氮罐保存?zhèn)溆谩Ｊ占涗浕颊叩哪挲g、獲卵數(shù)，按年齡將患者分成2組(高齡組：≥35歲，9人；年輕組：<35歲，21人)。效應(yīng)細(xì)胞的制備：無菌抽取枸櫞酸鈉抗凝的正常人外周靜脈血100ml，5％BSA-D-Hank’s液將血液等倍稀釋，用淋巴細(xì)胞分離液分離PBSC細(xì)胞，20℃離心2000r/min，20min。吸取中間白色絮狀細(xì)胞層，用

5、5％BSA-D-Hank’s液洗滌處理，棄上清。去紅細(xì)胞處理，重復(fù)離心洗滌兩次。將獲得的細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色，確定細(xì)胞活力>95％，計(jì)數(shù)后，將PBSC細(xì)胞調(diào)成濃度為2×10<'7>/ml細(xì)胞懸液備用。 靶細(xì)胞的制備：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的K<,562>細(xì)胞，1200r/min離心8min，棄上清，加人5％BSA-RPMI-1640液洗滌兩次。將獲得的細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色，確定細(xì)胞活力>95％，計(jì)數(shù)后，用5％BSA-RPMI-1640液將靶細(xì)胞調(diào)成

6、濃度為2×10<'5>/ml細(xì)胞懸液備用。 NK細(xì)胞活性的測(cè)定采用乳酸脫氫酶釋放法，在96孔板中按測(cè)定目的加人PBSC細(xì)胞、K<,562>細(xì)胞、卵泡液、5％BSA-RPMI-1640液，1％NP-40,同時(shí)設(shè)最大釋放孔，自然釋放孔，NK細(xì)胞活性對(duì)照孔。孵育培養(yǎng)后加入LDH底物液，終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀(λ=570nm)讀取OD值并計(jì)算NK細(xì)胞殺傷活性：NK細(xì)胞殺傷活性(％)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-自然釋放對(duì)照孔OD值)/(最大釋放孔OD值

7、-自然釋放孔對(duì)照孔OD值)×100％ 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 不同濃度的IVF-ET患者卵泡液對(duì)正常人外周血NK細(xì)胞殺傷活性有顯著影響。當(dāng)效靶細(xì)胞比為100：1時(shí)，4倍稀釋的IVF-ET患者卵泡液對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性有增強(qiáng)作用，與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)；8倍稀釋的IVF-ET患者卵泡液對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性也有增強(qiáng)作用，與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)；且兩組

8、不同稀釋濃度的IVF-ET患者卵泡液對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響相比較，差異也有顯著性(P<0.01)。高齡組和年輕組患者4倍稀釋的卵泡液對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性影響，二者無顯著差異(P>0.05)；高齡組和年輕組患者8倍稀釋的卵泡液對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性影響，二者無顯著差異(P>0.05)。4倍稀釋的IVF-ET患者卵泡液對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性影響與其該周期獲卵數(shù)無相關(guān)性(P>0.05)；8倍稀釋的IVF-ET患者卵泡液對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性影響與其該周

9、期獲卵數(shù)無相關(guān)性(P>0.05)。卵泡是由卵母細(xì)胞及其周圍的顆粒細(xì)胞層和卵泡膜細(xì)胞層構(gòu)成，卵泡中含有多種對(duì)卵細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟及排卵有調(diào)節(jié)作用的激素及細(xì)胞因子，各種細(xì)胞因子與卵巢功能密切相關(guān)，并具有特異性受體，參與一系列生殖過程，并對(duì)卵巢甾體激素的分泌有重要調(diào)節(jié)作用。其中一部分激素及細(xì)胞因子如雌激素、孕激素、白介素-1，2，6、干擾素、腫瘤壞死因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等與免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)，發(fā)揮了

10、重要功能。 自然殺傷細(xì)胞(NK)具有分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞毒效應(yīng)，同時(shí)NK細(xì)胞的殺傷活性也受多種細(xì)胞因子的調(diào)控，它門的主要功能是在細(xì)胞免疫，在腫瘤免疫、抗病毒感染中均起到重要的作用。NK細(xì)胞與妊娠有著密切關(guān)系，在正常未孕子宮內(nèi)膜存在，妊娠后是子宮內(nèi)膜中增加最明顯的免疫職能細(xì)胞，其高度表達(dá)穿孔素為早孕期間滋養(yǎng)層細(xì)胞侵人蛻膜提供幫助，且分泌多種細(xì)胞因子，形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)，彼此協(xié)調(diào)，在母胎界面的免疫調(diào)節(jié)中NK細(xì)胞發(fā)揮重要作用，某些機(jī)制可能與惡

11、性腫瘤的入侵有相似之處。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明IVF-ET超促排卵周期中患者卵泡液總體上對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性有增強(qiáng)作用，對(duì)該結(jié)果擬從兩方面進(jìn)行分析：(1)NK細(xì)胞能識(shí)別區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，因而能發(fā)揮免疫監(jiān)視作用。目前NK細(xì)胞與調(diào)控細(xì)胞靶細(xì)胞和調(diào)控分子(如識(shí)別受體的配體)的相互作用采用的方法均不是單細(xì)胞或單分子的行為觀察，亦無法達(dá)到實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的目的，更多反映的是復(fù)雜生物體系的整體反應(yīng)，而非具體連續(xù)的觀察。NK細(xì)胞生命活動(dòng)集中于特異性受體

12、識(shí)別，NK細(xì)胞活化涉及諸多識(shí)別信號(hào)的整和，主要包括識(shí)別受體和細(xì)胞因子受體兩大類。兩大類受體中又各自含有識(shí)別性受體和活化類受體，這些因素的總和將決定NK細(xì)胞是發(fā)揮免疫監(jiān)視功能，還是使NK細(xì)胞活化處于抑制狀態(tài)以利用腫瘤或病原體逃逸。NK細(xì)胞抑制受體(KiUer cell inhibitory receptor，KIR)和NK細(xì)胞激活受體(Killer cell activa-ting receptor，KAR)在機(jī)體的免疫監(jiān)視功能中發(fā)揮極

13、其重要的作用。在同一細(xì)胞上表達(dá)的KIR與KAR相互協(xié)調(diào)，在正常情況下，抑制性信號(hào)占主導(dǎo)地位，避免正常自身細(xì)胞被NK細(xì)胞殺傷；如傳遞激活性信號(hào)在NK細(xì)胞的信號(hào)傳遞過程中占主要地位，可導(dǎo)致表達(dá)靶細(xì)胞被殺傷，提示MHC分子可能主要表達(dá)在一些非正常的細(xì)胞上。本實(shí)驗(yàn)NK細(xì)胞殺傷活性的增強(qiáng)是其表達(dá)的各種受體與相應(yīng)的配體受卵泡液內(nèi)各種激素及細(xì)胞因子作用后，KAR在免疫監(jiān)視中占優(yōu)勢(shì)地位的結(jié)果。(2)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)為直接溶解和分泌細(xì)胞因子兩

14、個(gè)方面，NK細(xì)胞可以產(chǎn)生TNF-α、IFN-γ和IL-1，這些細(xì)胞因子在NK細(xì)胞抗癌反應(yīng)中有十分重要地位。其中IFN-γ在thl型免疫反應(yīng)的形成過程中發(fā)揮著重要作用，可活化巨噬細(xì)胞并使其分泌細(xì)胞因子，在這兩種免疫效應(yīng)細(xì)胞間形成正反饋回路。研究發(fā)現(xiàn)卵泡液中存在著IL-1活性物質(zhì)及TNF，因此我們認(rèn)為這些細(xì)胞因子在一定程度上參與了NK細(xì)胞發(fā)揮殺傷活性的作用過程。 不同年齡組患者卵泡液對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性影響無顯著差異，從分析其原因可能

15、是因?yàn)橛捎谀挲g因素不同造成的卵巢生殖內(nèi)分泌功能不同所引起的卵泡液成分不同對(duì)NK細(xì)胞殺傷功能影響的確沒有差異。也可能由于年齡不同造成卵泡液微環(huán)境內(nèi)增強(qiáng)及抑制NK細(xì)胞殺傷活性的成分均發(fā)生變化，但二者的作用互相抵消，因此在總體上對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響沒有差異。 不同患者的卵泡液對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響與其獲卵數(shù)之間無相關(guān)性。分析患者該周期因卵巢反應(yīng)性不同所引起的卵泡生長(zhǎng)發(fā)育及成熟，以及連帶引起的卵泡液內(nèi)激素水平及細(xì)胞因子水平不同對(duì)N

16、K細(xì)胞殺傷活性影響無相關(guān)關(guān)系。 在此基礎(chǔ)上，計(jì)劃下一步對(duì)卵泡液中的各種成分含量做以檢測(cè)，以了解它們?cè)趯?duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響中扮演的具體角色。這對(duì)開發(fā)與卵泡液有關(guān)的產(chǎn)品，研究抗腫瘤藥物及胚胎特異相關(guān)避孕藥以及提高動(dòng)物的繁殖，提高人類輔助生殖技術(shù)的成功率有重要意義。 1.IVF-ET周期患者卵泡液對(duì)正常人外周血中NK細(xì)胞的殺傷活性有增強(qiáng)作用，而且不同濃度IVF-ET周期患者卵泡液對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響有顯著差異。