第一部分阿爾茨海默病中I2PP2A-SET核運輸障礙的機制研究;第二部分黃連素對花萼海綿誘癌素CA誘導(dǎo)的HEK293細胞毒性和tau蛋白過度磷酸化的保護作用及其機制.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分、阿爾茨海默病中I2PP2A/SET核運輸障礙的機制研究
　　背景：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)患者腦中蛋白磷酸酯酶PP2A活性降低，并被認為是導(dǎo)致tau蛋白過度磷酸化促細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)形成的主要原因。然而，AD腦內(nèi)參與調(diào)節(jié)PP2A活性的機制尚未明了。Li等從牛腎抽提物中純化出兩種熱穩(wěn)定

2、蛋白I1PP2A（PHAP I）和I2PP2A（SET），二者均能特異且高效地抑制PP2A活性。在AD患者腦內(nèi)，核蛋白SET水平顯著增高，且主要分布在嗅球、海馬、大腦皮質(zhì)、尾殼核、丘腦等腦區(qū)；作為核蛋白， SET從核轉(zhuǎn)運至胞漿，并發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)元胞漿內(nèi)PP2A及異常過度磷酸化的tau蛋白共定位。上述研究說明AD患者腦內(nèi)出現(xiàn)了胞漿SET異常聚積并且是tau蛋白過度磷酸化的關(guān)鍵上游機制。然而，核蛋白SET如何滯留并聚積于胞漿以及SET抑制PP2

3、A活性的分子機制尚不清楚。親核蛋白的核運輸過程主要通過核定位信號(nuclear localization signal, NLS)和核輸出信號(nuclear export signal, NES)來調(diào)節(jié)。其中，核定位信號NLS通常是親核蛋白內(nèi)具有一個帶正電荷的肽核心（多聚賴氨酸），并且能保證整個蛋白質(zhì)能夠通過核孔復(fù)合體(Nuclear Pore Complex, NPC)被運到細胞核內(nèi)的特殊的短肽氨基酸序列。核輸出信號NES是指可被

4、核孔復(fù)合體上的輸出受體所識別，引導(dǎo)大分子從細胞核經(jīng)NPC輸出到細胞質(zhì)的一段氨基酸序列，通常富含亮氨酸。本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)：分別轉(zhuǎn)染SET及攜帶外源性NLS的SET/NTF（N-Terminal Fragments, NTF即SET的N端片段，包含有在兩個loxP位點間插入了外源性核定位信號NLS）于COS7細胞株，48h后，發(fā)現(xiàn)全長SET定位于核內(nèi)、攜帶外源性NLS的SET/NTF片段也主要定位于細胞核內(nèi)；但用Cre重組酶切除loxP

5、位點間的NLS后，SET的N端片段轉(zhuǎn)位于胞漿，且與tau共定位。這些結(jié)果提示：核定位信號NLS異?？赡苁菍?dǎo)致SET核運輸障礙的一個關(guān)鍵因素；內(nèi)源性PP2A特異性抑制劑 SET高表達可能通過抑制PP2A活性及其下游因素在AD樣神經(jīng)病變及學(xué)習(xí)記憶障礙中發(fā)揮重要作用。磷酸化修飾是核運輸?shù)闹匾{(diào)節(jié)機制，尤其是NLS磷酸化修飾被認為是影響其與核輸入蛋白結(jié)合形成核輸入復(fù)合物的一個重要因素。通過磷酸氨基酸分析、HPLC和放射性序列分析鑒定，Ser-9

6、確定為SET主要的磷酸化位點。巧合的是，以Ser-9為中心的一段結(jié)構(gòu)域序列(6-10aa)AKVSKK富含賴氨酸(lysine,K)，與目前多個公認的富含賴氨酸(堿性氨基酸，易于錨定核輸入蛋白)的核定位信號NLS序列KKXXKX或XKXXKK(X為其它氨基酸)一致。因此，此段結(jié)構(gòu)域中Ser9的磷酸化可作為研究NLS調(diào)節(jié)SET核運輸?shù)囊粋€重要靶點。作為NLS特征性的富聚賴氨酸，其中每一賴氨酸對NLS錨定核輸入蛋白的貢獻進而影響核蛋白輸入的

7、作用可能會有不同，從而影響NLS的功能。
　　目的：
　　探討SET核運輸障礙的調(diào)節(jié)機制以及SET對PP2A活性抑制的分子機制，進一步闡明AD發(fā)病機理和尋求有效藥物開發(fā)的分子靶點。
　　方法：
　　利用人類最長（tau441）基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293細胞，即HEK293/tau細胞。在37C含95％的空氣和5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293/tau細胞。磷酸化絲氨

8、酸9位點SET多克隆抗體anti-SET(phospho S9) antibody rabbit polyclonal antibody由Abmart公司提供。Iqbal博士友情饋贈AD患者以及年齡匹配的正常組大腦皮層切片。利用免疫組織化學(xué)方法檢測AD大腦皮層神經(jīng)元SET絲氨酸ser9位點的磷酸化程度及其亞細胞定位。通過基因定點突變SET內(nèi)絲氨酸Ser-9為非極性氨基酸丙氨酸(Ala, A)，即SET(S9A)和極性帶負電荷氨基酸(Gl

9、u, E)，即SET(S9E)，分別攜帶His標簽，模擬SET的持續(xù)非磷酸化與磷酸化；再分別突變His-SET此段序列中的堿性氨基酸賴氨酸Lys-7， Lys-10和Lys-11為中性氨基酸丙氨酸，分別轉(zhuǎn)染SET及SET突變體于HEK293/tau細胞株，48h后，通過激光共聚焦檢測上述突變SET的亞細胞分布。通過免疫共沉淀方法檢測相比于野生型SET，SET突變體與核輸入蛋白Importin的結(jié)合程度。通過絲氨酸/蘇氨酸檢測試劑盒(Pr

10、omega, Cat.＃ V2460)測定SET磷酸化修飾對PP2A活性的影響；利用免疫印跡方法檢測SET磷酸化修飾后對tau蛋白Ser396, Thr231, Ser262, Thr205, Ser214, Ser404和Ser199位點磷酸化程度的影響。為了進一步明確6AKVSKK11序列是SET的核定位信號，并且在SET核運輸中起到關(guān)鍵作用，通過人工合成Tat-NLS(Tat-AAKVSKKE)肽段，利用激光共聚集熒光顯微鏡觀察T

11、at-NLS對內(nèi)源性SET核定位及細胞內(nèi)分布的影響。
　　結(jié)果：
　　本實驗中我們發(fā)現(xiàn)AD大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中SET絲氨酸Ser-9位點發(fā)生磷酸化，并且磷酸化SET在胞漿中發(fā)生聚集?；蚨c突變SET內(nèi)絲氨酸Ser-9為His-SET(S9A)和His-SET(S9E)，分別模擬SET的持續(xù)非磷酸化與磷酸化。然后分別轉(zhuǎn)染野生型SET(His-SET WT)及SET突變體His-SET(S9A)和His-SET(S9E)于HEK2

12、93/tau細胞株，48h后，發(fā)現(xiàn)野生型SET及SET突變體His-SET(S9A)定位于核內(nèi)，然而His-SET(S9E)，即模擬SET Ser-9持續(xù)磷酸化的SET突變體，大部分轉(zhuǎn)位于胞漿，并在胞漿中滯留。利用核蛋白提取試劑盒分離提取胞漿胞核蛋白，發(fā)現(xiàn)核蛋白中SET突變體His-SET(S9E)的量明顯減少，而在胞漿蛋白中明顯增加；通過免疫共沉淀方法檢測到模擬Ser-9磷酸化修飾的His-SET(S9E)與importinα，imp

13、ortinβ的結(jié)合減少，引起SET核輸入復(fù)合物形成障礙，導(dǎo)致SET入核困難而滯留于胞漿。作為SET磷酸化修飾的上游激酶酪蛋白激酶Ⅱ（Casein Kinase II, CKII）水平在AD腦內(nèi)上調(diào)，為進一步探討外源性刺激對內(nèi)源性SET磷酸化修飾及其亞細胞分布的影響。我們在細胞水平上調(diào)CKⅡ表達水平，結(jié)果顯示：CKⅡ可以顯著磷酸化內(nèi)源性SET，并且磷酸化修飾后SET在胞漿中大量聚集。因此，CKⅡ可能成為AD治療的一個新的藥物靶點。我們還觀

14、察到SET絲氨酸Ser-9位點磷酸化修飾后與PP2A催化亞基C結(jié)合更強，從而顯著抑制PP2A活性，并導(dǎo)致tau蛋白在Ser396, Thr231, Ser262, Thr205, Ser214, Ser404, PHF-1和Ser199位點發(fā)生過度磷酸化。為明確以Ser-9為中心的此段結(jié)構(gòu)域序列(6-10aa)AKVSKK可能為SET的核定位信號，我們通過基因定點突變SET此段結(jié)構(gòu)域上的賴氨酸，發(fā)現(xiàn)僅His-SET(K11A)突變體在胞

15、漿中出現(xiàn)滯留現(xiàn)象，免疫共沉淀的結(jié)果顯示His-SET(K11A)突變體與importinα，importinβ的結(jié)合減少，確定Lysine11對SET錨定核輸入蛋白的貢獻最大，是影響SET入核的功能氨基酸。固相合成并純化肽段Tat-NLS(Tat-AAKVSKKE)，將肽段加入到HEK293/tau細胞中孵育48小時，激光共聚集熒光顯微鏡下觀察到Tat-NLS可以競爭性抑制內(nèi)源性SET與核輸入蛋白importin結(jié)合，從而導(dǎo)致內(nèi)源性SE

16、T入核障礙而滯留胞漿。上述結(jié)果提示6AKVSKK11是SET的核定位信號；位于SET核定位信號的Ser-9磷酸化修飾導(dǎo)致SET滯留胞漿，進而PP2A活性并引起下游AD樣病理學(xué)變化。
　　結(jié)論：
　　1. AD患者腦內(nèi)神經(jīng)元SET Ser-9位點顯著磷酸化是導(dǎo)致SET滯留胞漿的關(guān)鍵原因；
　　2.6AKVSKK11序列是SET的核定位信號，其中賴氨酸Lysine11是SET核定位信號上的功能氨基酸。
　　第二部分、

17、黃連素對花萼海綿誘癌素CA誘導(dǎo)的HEK293細胞毒性和tau蛋白過度磷酸化的保護作用及其機制
　　背景及目的：
　　黃連素，又稱小檗堿(Berberine, BR)，是從中草藥黃連等植物中提取分離得到的一類異喹啉類生物堿，屬季銨類化合物。黃連素具有多種保健作用，并擁有各種生化和藥理活性，包括抗腹瀉，抗心律失常和抗腫瘤等活性。近年來，藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)小檗堿對治療AD有潛在作用，包括對阿爾茨海默病(Alzheimer diseas

18、e, AD)模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙的改良；改變β-淀粉樣蛋白前體（AβPP）加工處理過程和減少Aβ的分泌；通過降低海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)游離Ca2+從而減少Aβ誘導(dǎo)的細胞凋亡；以及具有抗膽堿酯酶活性。此外，黃連素還能在HCT-116細胞調(diào)節(jié)GSK-3β活性。根據(jù)以上報道，黃連素可能是一個治療AD的潛在藥物。由過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau蛋白構(gòu)成的皮層神經(jīng)原纖維纏結(jié)NFTs數(shù)量與阿爾茨海默病的臨床癡呆程度呈正相關(guān)，提示tau蛋白過度磷酸化促

19、NFTs形成在AD發(fā)病中起關(guān)鍵作用。到目前為止，受累神經(jīng)元內(nèi)蛋白激酶/蛋白磷酸酶動態(tài)平衡失調(diào)是導(dǎo)致AD樣tau蛋白異常過度磷酸化的直接原因。其中糖原合酶激酶-3(GSK-3）和蛋白磷酸酶(PP）-2A，分別是最有關(guān)聯(lián)的激酶和磷酸酶。然而，到現(xiàn)在為止，一直沒有研究報道黃連素是否影響tau蛋白磷酸化。為此，本研究探討了在人胚腎轉(zhuǎn)tau細胞（HEK293/tau）中小檗堿對花萼海綿誘癌素（Calyculin A, CA, PP2A和PP1的抑

20、制劑）誘導(dǎo)tau過度磷酸化的影響及其相關(guān)酶活性的變化。
　　方法：
　　利用人類最長（tau441）基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293細胞，即HEK293/tau細胞。在37?C含95％的空氣和5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293/tau細胞。在6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時后，無血清培養(yǎng)基稀釋的2.5nM calyculin A預(yù)處理細胞12小時，然后分別給予0，5，10，20，50，或10

21、0微克/毫升小檗堿處理細胞24小時。用CCK-8細胞計數(shù)試劑盒來測定細胞活力和小檗堿的最佳劑量。隨后，通過顯微鏡成像，Hoechst33342染色，TUNEL法，流式細胞儀和caspase-3活性測定來觀測黃連素對calyculin A誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)變化和HEK293/tau細胞凋亡的影響。利用免疫印跡來檢測20微克/毫升小檗堿對calyculin A誘導(dǎo)的Ser198/199/202（Tau-1位點）， Ser396，Ser404，Th

22、r205和Thr231等位點tau蛋白過度磷酸化的影響，以及糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）Tyr216和Ser9的磷酸化程度。采用絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性檢測試劑盒（Promega公司，貨號V2460）來測定PP2A活性。通過測定丙二醛水平和超氧化物歧化酶活性來檢測小檗堿對calyculin A誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的保護作用。
　　結(jié)果：
　　1)20μg/ml小檗堿作用人胚腎293/tau細胞24小時可顯著減少2.5nM花萼海

23、綿誘癌素CA誘導(dǎo)的細胞死亡，而僅給予小檗堿處理對正常細胞無任何影響；
　　2)20μg/ml小檗堿可顯著減少2.5nM花萼海綿誘癌素CA誘導(dǎo)的細胞形態(tài)改變及凋亡；
　　3)20μg/ml小檗堿可顯著降低2.5nM花萼海綿誘癌素CA誘導(dǎo)的tau蛋白Ser198/199/202(Tau-1位點), Ser396, Ser404, Thr205,和Thr231位點過度磷酸化程度；
　　4)20μg/ml小檗堿可顯著逆轉(zhuǎn)2.5

24、nM花萼海綿誘癌素CA誘導(dǎo)的PP-2A活性下降和GSK-3β活性增強，研究其作用機制發(fā)現(xiàn)GSK-3β在Tyr216位點磷酸化程度明顯下降而Ser9位點磷酸化程度明顯增強；
　　5)20μg/ml小檗堿可通過降低丙二醛水平和增加超氧化物歧化酶活性從而保護2.5nM花萼海綿誘癌素CA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。
　　結(jié)論:小檗堿能減輕由花萼海綿誘癌素CA誘導(dǎo)的人胚腎293/tau細胞毒性作用;可能通過恢復(fù)蛋白磷酸酶PP2A活性和下調(diào)糖原合酶