胃癌相關(guān)基因GCRG213在真核細胞的定位及其對MKN45細胞的作用.pdf

1、胃癌相關(guān)基因GCRG213是由本實驗室應用熒光標記的mRNA差異顯示(DDRT-PCR)技術(shù)篩選出一條在腸型胃癌組織、癌旁和正常組織間差異表達的新基因，生物信息學分析表明它具有完整的開放閱讀框架，編碼含有142個氨基酸的產(chǎn)物。原位雜交和Northernblot顯示該基因在胃癌和癌旁不典型增生組織的表達高于正常胃組織。同源比對，該基因與機體中堿基切除修復的關(guān)鍵酶APE/Ref-1序列有61％同源性并且含有其保守區(qū)的功能位點，可能是APE/

2、Ref-1的一個變異體。APE/Ref-1(apurinic/apyrimidinicendonucleas)即人類無嘌呤無嘧啶核酸內(nèi)切酶，是修復AP位點的關(guān)健酶，它還有調(diào)節(jié)參與細胞增殖、分化的轉(zhuǎn)錄因子活性的作用。近年來研究表明，APE/Ref-1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，其表達在前列腺、卵巢、子宮、結(jié)腸、生殖細胞等多種惡性腫瘤中明顯增高，且可以協(xié)助判斷一些腫瘤的預后。因此明確胃癌相關(guān)基因GCRG213的功能，對胃癌的發(fā)病機制、診斷治療

3、及預后判斷將提供新的思路和手段。 目的：研究胃癌相關(guān)基因GCRG213在真核細胞的定位及其正義、反義、siRNA轉(zhuǎn)染對胃癌細胞MKN45的影響 方法：1、采用PCR技術(shù)，從pGEM-T質(zhì)粒上選擇性擴增出包含完整ORF在內(nèi)的人胃癌相關(guān)基因GCRG213的DNA片段，將目的片段兩端分別引入限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI識別位點，克隆至真核表達載體pEGFP-N1。 2、將測序正確的陽性重組子pEGFP-Nl-GCR

4、G213采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細胞，激光共聚焦技術(shù)檢測GCRG213基因在真核細胞內(nèi)的蛋白定位。 3、將從pGEM-T質(zhì)粒上擴增出的胃癌相關(guān)基因GCRG213的DNA片段，兩端分別引入限制性內(nèi)切酶KpnI、BamHI和EcoRI、BamHI識別位點，按正向、反向克隆入真核表達載體pcDNA3.1(+)。 4、設計兩對針對GCRG213可轉(zhuǎn)錄為小干擾RNA(siRNA)的DNA片段，退火后插入干擾表達載體IMG-80

5、0。 5、測序正確的重組子pcDNA3.1-a(含GCRG213正向克隆)，pcDNA3.1-b(含GCRG213反向克隆)，IMG-800-1(含干擾片段1)，IMG-800-2(含干擾片段2)和空載體經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胃癌細胞系MKN45細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，采用半定量RT-PCR及Western免疫印跡法比較轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的MKN45細胞中GCRG213在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達差異。 6、選取穩(wěn)定

6、轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的MKN45細胞，采用細胞計數(shù)法繪制細胞生長曲線，流式細胞儀分析細胞的增殖狀態(tài)，AnnexinVFITC/PI雙標記法檢測凋亡細胞，平板克隆形成實驗、裸鼠移植瘤實驗分析轉(zhuǎn)染細胞體內(nèi)外成瘤性，透射電鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞超微結(jié)構(gòu)的改變，MTT法檢測轉(zhuǎn)染細胞在體外對絲裂霉素、VP16、紫素、5-FU和艾恒5種化療藥物的敏感性。 結(jié)果：1、經(jīng)測序證實，GCRG213正確克隆入真核表達載體pEGFP-N1，組成陽性重組子pEGFP

7、-N1-GCRG213。 2、測序正確的pEGFP-N1-GCRG213重組子經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-7細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察GCRG213蛋白在胞核和胞漿中均有表達。 3、經(jīng)測序證實，GCRG213正向克隆和反向克隆正確插入真核表達載體pcDNA3.1(+)，組成重組子pcDNA3.1-a(含正向克隆)，pcDNA3.1-b(含反向克隆)；干擾片段退火后正確插入干擾表達載體IMG-800，組成重組子IMG-800-1(

8、含片段1)，IMG-800-2(含片段2)。 4、重組子pcDNA3.1-a，pcDNA3.1-b，IMG-800-1，IMG-800-2和空載體經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胃癌細胞系MKN45細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。 5、與對應的空載體比較，RT-PCR結(jié)果為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-a的MKN45細胞中其mRNA的表達上調(diào)35.4％，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-b的MKN45細胞中其mRNA的表達下調(diào)32.1％，轉(zhuǎn)染siR

9、NA的MKN45細胞中其mRNA的表達分別下調(diào)44.9％和49.5％；Western印跡法結(jié)果為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-a的MKN45細胞中其蛋白的表達上調(diào)49.4％，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-b的MKN45細胞中其蛋白的表達下調(diào)50.3％，轉(zhuǎn)染siRNA的MKN45細胞中其蛋白的表達分別下調(diào)55.3％和64.2％。 6、采用細胞計數(shù)法繪制細胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了GCRG213正向克隆的MKN45細胞生長速度明顯快于轉(zhuǎn)染空載體的細胞

10、，而轉(zhuǎn)染了GCRG213反向克隆的MKN45細胞及轉(zhuǎn)染siRNA的MKN45細胞生長速度明顯慢于轉(zhuǎn)染空載體的細胞。 7、采用流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染細胞的增殖狀態(tài)，結(jié)果為轉(zhuǎn)染了GCRG213正向克隆的MKN45細胞比轉(zhuǎn)染空載體的細胞增殖速度加快，其細胞周期表現(xiàn)為處于G0-G1期的細胞減少，G2/M期和/或S期的細胞比例增多；而轉(zhuǎn)染了GCRG213反向克隆的MKN45細胞及轉(zhuǎn)染siRNA的MKN45細胞比轉(zhuǎn)染空載體的細胞增殖速度減慢，其

11、細胞周期表現(xiàn)為處于G0-G1期的細胞有所增加，G2/M期和/或S期的細胞比例減少。 8、采用AnnexinVFITC/PI雙標記法檢測凋亡細胞，結(jié)果為轉(zhuǎn)染了GCRG213正向克隆的MKN45細胞凋亡率低于轉(zhuǎn)染空載體的細胞，而轉(zhuǎn)染了GCRG213反向克隆的MKN45細胞及轉(zhuǎn)染siRNA的MKN45細胞凋亡率高于轉(zhuǎn)染空載體的細胞。 9、平板克隆形成實驗可見，轉(zhuǎn)染了GCRG213正向克隆的MKN45細胞其細胞克隆形成數(shù)量高于轉(zhuǎn)

12、染空載體的細胞，而轉(zhuǎn)染了GCRG213反向克隆的MKN45細胞及轉(zhuǎn)染siRNA的MKN45細胞其細胞克隆形成數(shù)量低于轉(zhuǎn)染空載體的細胞。 10、在裸鼠體內(nèi)進行的轉(zhuǎn)染細胞的成瘤性實驗可見，轉(zhuǎn)染了GCRG213正向克隆的MKN45細胞在裸鼠體內(nèi)成瘤性高于轉(zhuǎn)染空載體的細胞，而轉(zhuǎn)染了GCRG213反向克隆的MKN45細胞及轉(zhuǎn)染siRNA的MKN45細胞在裸鼠體內(nèi)成瘤性低于轉(zhuǎn)染空載體的細胞。 11、透射電鏡下可觀察到轉(zhuǎn)染了GCRG2

13、13正向克隆的MKN45細胞與轉(zhuǎn)染空載體的MKN45細胞相比，前者胞漿內(nèi)核仁增多且多有內(nèi)褶，核分裂像增多，同時細胞表面微絨毛密集、細長，而轉(zhuǎn)染了GCRG213基因反向克隆的MKN45細胞及轉(zhuǎn)染siRNA的MKN45細胞與轉(zhuǎn)染空載體的MKN45細胞相比，前者胞核變小，核仁減少、濃縮，并染色質(zhì)增多，細胞表面微絨毛變粗、變短，數(shù)量減少。 12、MTT法檢測轉(zhuǎn)染細胞在體外對絲裂霉素、VP16、紫素、5-FU和艾恒5種化療藥物的敏感性。與

14、轉(zhuǎn)染空載體的MKN45細胞相比，5-FU和艾恒對轉(zhuǎn)染了GCRG213正向克隆的MKN45細胞抑制率下降，而對轉(zhuǎn)染了siRNA的MKN45細胞抑制率增加；絲裂霉素、VP16和紫素對上述轉(zhuǎn)染細胞的抑制率無明顯差異。 結(jié)論：1、GCRG213蛋白在胞核和胞漿中均有表達。 2、胃癌相關(guān)基因GCRG213可促進腫瘤細胞的生長和增殖，抑制腫瘤細胞的凋亡，在體內(nèi)和體外均可促進腫瘤細胞的成瘤性，可能是一個新發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤癌變的促進因素。

15、 3、siRNA轉(zhuǎn)染及GCRG213反義轉(zhuǎn)染可抑制腫瘤細胞的生長和增殖，促進腫瘤細胞的凋亡，可抑制腫瘤細胞的成瘤性。 4、透射電鏡結(jié)果提示GCRG213有促進腫瘤細胞分裂和轉(zhuǎn)移的傾向，而siRNA轉(zhuǎn)染及GCRG213反義轉(zhuǎn)染有改善腫瘤細胞惡性程度和抑制轉(zhuǎn)移的傾向。 5、MTT法檢測轉(zhuǎn)染細胞在體外對絲裂霉素、VP16、紫素、5-FU和艾恒5種化療藥物的敏感性。5-FU和艾恒對轉(zhuǎn)染了GCRG213正向克隆的MKN45