hPXR基因單核苷酸多態(tài)性及其單倍型與CYP3A4代謝表型的關(guān)系.pdf

1、藥物代謝是藥物在體內(nèi)消除的主要決定因素。藥物在體內(nèi)代謝向兩個(gè)方向發(fā)展：代謝解毒和代謝活化，其中大部分藥物的代謝在肝臟進(jìn)行。細(xì)胞色素(CYP450)酶系是肝臟中主要的代謝酶系，其中CYP3A4是細(xì)胞色素P450系統(tǒng)的重要亞型，占肝臟中P450酶總含量的25％，臨床上50％的藥物通過(guò)此酶代謝而排出體外。臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，大多通過(guò)CYP3A4．代謝的藥物都存在顯著的個(gè)體差異和種族差異，這對(duì)于治療窗窄、安全指數(shù)低的藥物很易發(fā)生藥物毒性反應(yīng)和達(dá)不到

2、療效。并且絕大部分藥物因需要長(zhǎng)期應(yīng)用和合并用藥，常發(fā)生自身代謝誘導(dǎo)，即隨著藥物應(yīng)用時(shí)間和劑量的增加，藥物在體內(nèi)的代謝增強(qiáng)，從而需不斷加大用藥劑量。但不同患者增加強(qiáng)度不同。 近年來(lái)一系列研究發(fā)現(xiàn)，人孕烷X受體(human pregnane X receptor, hPXR)作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與CYP3A4基因誘導(dǎo)表達(dá)。hPXR可以被許多臨床藥物激活，包括鈣通道拮抗劑、抑制素、降糖藥、HIV蛋白酶抑制劑、抗激素藥、抗癌藥，這些

3、藥物的大多數(shù)都是依賴(lài)CYP3A4代謝而排出體外的。hPXR基因已進(jìn)行了功能研究的29個(gè)SNP中，發(fā)生在編碼區(qū)的11個(gè)SNP有7個(gè)可引起hPXR蛋白序列的差異，經(jīng)細(xì)胞重組表達(dá)研究顯示出利福平誘導(dǎo)CYP3A4轉(zhuǎn)錄活化的差異；另外，在3，端和5’端非編碼區(qū)及近端內(nèi)含子的18個(gè)SNP中，經(jīng)細(xì)胞重組表達(dá)研究已明確有8個(gè)SNP影響藥物代謝酶CYP3A4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 目的： 第一部分hPXR基因SNP檢測(cè)及單倍型分析 在中國(guó)健

4、康漢族人群中廣泛篩查hPXR基因的SNP，明確其單倍型分布，并與其它種族比較，明確種族差異。 方法： 用PCR-直接測(cè)序法對(duì)hPXR基因的編碼區(qū)、近端內(nèi)含子、3’及5'-UTR的SNP進(jìn)行廣泛篩查，計(jì)算各SNP頻率，并驗(yàn)證是否符合Hardy—Weinberg平衡。與其它種族比較SNP頻率差別采用x<'2>檢驗(yàn)。PHASE V.2.1進(jìn)行單倍型分析。 結(jié)論： 中國(guó)健康漢族人群發(fā)現(xiàn)16種SNP，其中未見(jiàn)報(bào)道的

5、新SNP有2個(gè)(-25439A>G和7637C>T)；有9個(gè)為在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中直接登陸而未經(jīng)確證的SNP(其中兩個(gè)位于hPXR基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵部位，本研究將在第二部分對(duì)這兩個(gè)突變的功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究)；另外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的SNP的種類(lèi)，頻率和常見(jiàn)的單倍型的種類(lèi)與已報(bào)道的其它種族存在顯著性差異。 目的： 第二部分 hPXR啟動(dòng)子區(qū)域的突變-24622A>T 與-24446C>A的功能研究 第一部

6、分試驗(yàn)中在hPxR基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域發(fā)現(xiàn)一24622A>T及一24446C>A兩個(gè)突變，發(fā)生頻率分別為3.5％及2.4％，前者在美國(guó)黑人中有報(bào)道(發(fā)生率3.1％)，后者僅見(jiàn)于亞洲人群(發(fā)生率3.6％)，在高加索人和美國(guó)黑人中未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此兩突變所處位置，推測(cè)可能會(huì)影響hPXR自身表達(dá)，從而影響受hPXR調(diào)控的下游基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。用報(bào)告基因的方法檢測(cè)這兩個(gè)突變對(duì)hPxR啟動(dòng)子功能的影響。 方法： 通過(guò)構(gòu)建三種1.

7、2kPxR—pGL3—Basic表達(dá)質(zhì)粒(T—24622T—pGL3、A-24446A—pGL3與靶片段無(wú)突變—pGL3)，以pGL3重組質(zhì)粒與phRL—CMV共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，考察一24622A>T及—24446C>A對(duì)PXR自身表達(dá)的影響。t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 這兩個(gè)發(fā)生于hPXR基因啟動(dòng)子關(guān)鍵區(qū)域的SNP-24622A>T與-24446C>A使PXR自身轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。

8、 第三部分 CYP3A4底物硝苯地平的質(zhì)譜檢測(cè)方法的建立與確認(rèn) 目的： 硝苯地平經(jīng)CYP3A4代謝，因而常用作探針?biāo)幏磻?yīng)CYP3A4代謝活性。本實(shí)驗(yàn)將在第四部分考察hPXR的不同單倍型對(duì)與CYP3A4代謝表型的關(guān)系，將以硝苯地平為探藥。故先建立硝苯地平及其代謝物氧化硝苯地平的質(zhì)譜檢測(cè)方法，并進(jìn)行驗(yàn)證，為下一步檢測(cè)受試者血漿中硝苯地平及氧化硝苯地平濃度，從而反應(yīng)相應(yīng)的CYP3A4活性奠定基礎(chǔ)。 方法：

9、1．建立硝苯地平及其代謝物氧化硝苯地平檢測(cè)的質(zhì)譜方法、液相方法及血漿樣本的萃取方法。 2．進(jìn)行全面的方法學(xué)驗(yàn)證：包括方法的精密度、準(zhǔn)確度、線性及最低檢測(cè)限、穩(wěn)定性及基質(zhì)效應(yīng)等。 結(jié)果： 1．建立了硝苯地平及其代謝物氧化硝苯地平的LC/MS/MS的檢測(cè)方法。萃取方法以尼群地平為內(nèi)標(biāo)，以無(wú)水乙醚：正己烷(3:1，v/v)為萃取劑。質(zhì)譜條件為：離子源EST，正離子掃描及選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM)，監(jiān)測(cè)離子為：m/z 3

10、47.1→315.0(硝苯地平)，m/z 345.1→248.3(氧化硝苯地平)及m/z 361.0→315.0(內(nèi)標(biāo))。液相條件：分離柱Hypersil BDS C18(150 mm×2.1 mm，i.d.，3μm，Elite HPLC，China)、流動(dòng)相為甲醇—水(80:20，v/v)(0.1％甲酸)，流速200μl/min。色譜保留時(shí)間為2.5分鐘。 2．方法學(xué)驗(yàn)證：硝苯地平及氧化硝苯地平的線性范圍均為0.5-100 n

11、g/ml。兩者的萃取回收率分別為81.3-89.1％和71.6-80.4％，兩者的日內(nèi)及日間精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性的RSD及偏離度均小于15％，符合生物樣本檢測(cè)的要求。結(jié)論：建立了LC/MS/MS方法檢測(cè)人血漿中硝苯地平及氧化硝苯地平濃度，方法精密度、準(zhǔn)確度好，靈敏度高，適用于人體藥動(dòng)學(xué)研究。 目的： 本實(shí)驗(yàn)主要考察hPXR誘導(dǎo)劑SJW(St John’s Wort，金絲桃素制劑)應(yīng)用前后，hPxR的不同單倍型對(duì)與CYP

12、3A4代謝表型的相關(guān)性，同時(shí)也考察了SNP-24622A>T和-24446C>A與CYP3A4代謝表型的相關(guān)性，為明確hPXR單倍型與CYP3A4藥物代謝表型間的關(guān)系，為探討CYP3A4代謝表型個(gè)體差異的原因提供試驗(yàn)依據(jù)；最終為臨床用藥個(gè)體化提供理論指導(dǎo)。 方法： 1.以本試驗(yàn)人群中最常見(jiàn)的兩種單倍型組成的三種單倍型對(duì)為研究對(duì)象，挑選10例受試者進(jìn)入藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)研究。(4人hapl&1，3人hapl&2和3人hap2&2)

13、 2.對(duì)上述所選受試者的CYP3A4的基因型進(jìn)行檢測(cè)，保證進(jìn)入藥動(dòng)學(xué)研究的受試者CYP3A4的基因型一致。 3.試驗(yàn)為雙周期自身對(duì)照，受試者服用SJW片劑每日三次，每次300mg。試驗(yàn)前后的CYP3A4活性用硝苯地平及其代謝物的AUC以及兩者的比值表示。硝苯地平及其代謝物的血藥濃度用LC/MS/MS檢測(cè)。4.試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)mean±SD表示，采用秩和非參數(shù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為具有顯著意義。結(jié)果： 1．Hapl&1，Hapl

14、&2和Hap2&2組中硝苯地平的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn) 在服用誘導(dǎo)劑SJW前后，所有受試者硝苯地平的AUC均顯著下降，相應(yīng)地，對(duì)于代謝物氧化硝苯地平，AUC均顯著升高，經(jīng)t-檢驗(yàn)，試驗(yàn)前后的改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明PXR被SJW誘導(dǎo)后，使CYP3A4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)，其底物(硝苯地平)的代謝加速，同文獻(xiàn)報(bào)道一致。 2．Hapl&2組中有與無(wú)突變-24622A>T對(duì)硝苯地平人體藥動(dòng)學(xué)的影響 在Hapl&2組中

15、，兩名受試者具有突變-24622A>T，而兩名受試者無(wú)此突變。無(wú)論有無(wú)-24622A>T突變，受試者服用誘導(dǎo)劑后，硝苯地平的AUC均下降約40％～45％；但代謝物AUC的升高卻因有無(wú)-24622A>T突變而有差異，無(wú)-24622A>T突變的受試者代謝物AUC升高33.8％，而有-24622A>T的受試者代謝物AUC僅升高11.3％。不過(guò)經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因而，該突變是否會(huì)對(duì)PXR的轉(zhuǎn)錄激活作用造成影響，還需進(jìn)一步研究。

16、 3．Hap7&1l組中有與無(wú)突變-24446C>A對(duì)硝苯地平人體藥動(dòng)學(xué)的影響 在第二部分實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用報(bào)告基因的方法發(fā)現(xiàn)突變-24446C>A使PXR自身表達(dá)顯著增強(qiáng)，推測(cè)其可能使PxR對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用增強(qiáng)。因而我們利用人體藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行初步驗(yàn)證。不過(guò)，受試者的選擇非常困難，因?yàn)橐ＷC入選的受試者的hPXR單倍型組成必須一致，但具有突變-24446C>A的7個(gè)健康志愿者中，其相互間的單倍型組成差異很大，很難找到

17、陰性對(duì)照，最終只入選了兩例受試者，單倍型組成為Hap7&ll，一個(gè)有-24446C>A突變，一個(gè)無(wú)此突變。 結(jié)論： 1．在中國(guó)人群常見(jiàn)的兩種hPXR基因單倍型組成的三種單倍型對(duì)中(Hapl＆1，Hapl＆2和Hap2&2)，Hap1&1對(duì)CYP3A4的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄激活作用最弱，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活作用最強(qiáng)。 2．單倍型組成Hap7＆11的hF)XR對(duì)腸道P—gp及CYP3A4的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活作用強(qiáng)于Hap1＆1，Hap1＆2和