半胱氨酰酰白三烯受體1拮抗劑孟魯司特抗腦缺血損傷的作用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證明半胱氨酰白三烯受體1(cysteinyl leukotriene receptor1，CysLT1受體)拮抗劑的抗腦缺血損傷作用。選擇性CysLT1受體拮抗劑普魯司特(pranlukast，ONO-1078)可抑制大鼠和小鼠的急性、亞急性及慢性局灶性腦缺血損傷。在小鼠局灶性腦缺血慢性期，普魯司特不僅可降低死亡率，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，還可抑制膠質(zhì)疤痕形成。但是，有待進(jìn)一步的闡明其他CysLT1受體拮抗劑抗腦缺血損傷的作用。在

2、細(xì)胞水平上，已經(jīng)報(bào)道CysLT1和CysLT2受體轉(zhuǎn)染對(duì)PC12細(xì)胞缺血性損傷的調(diào)節(jié)作用，CysLT1受體介導(dǎo)輕度缺血損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，但其在神經(jīng)元缺血損傷中的作用，還需要繼續(xù)深入探討。多數(shù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用的CysLT1受體拮抗劑是普魯司特，其作用是CysLT1受體拮抗劑共同的作用，還是該藥特有的作用?為此，研究了另一個(gè)CysLT1受體拮抗劑孟魯司特。孟魯司特[1-{[(1(R)-(3-(2-(7-氯-2-喹啉)-(E)-乙烯基)苯基

3、)-3-(2-(1-羥基-1-甲基乙基)苯基)丙基)硫醇]-甲基}環(huán)丙乙酸]是分子結(jié)構(gòu)不同于普魯司特的選擇性CysLT1受體拮抗劑。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，腹腔注射孟魯司特對(duì)小鼠急性局灶性腦缺血損傷有劑量依賴性保護(hù)作用，可減輕神經(jīng)癥狀、減小梗死體積、減輕神經(jīng)元缺失、減少血腦屏障通透性增高，治療時(shí)間窗在缺血后0.5 h，其作用強(qiáng)度和特點(diǎn)與普魯司特相似。但是，孟魯司特對(duì)局灶性腦缺血后慢性損傷的作用還未得到研究，因此，本研究第一部分在大鼠和小鼠局灶性腦

4、缺血模型中，觀察CysLT1受體拮抗劑孟魯司特對(duì)腦缺血慢性損傷是否有保護(hù)作用，口服是否有效。CysLT1受體拮抗劑除了選擇性阻斷CysLT1受體而發(fā)揮效應(yīng)外，還有不依賴于CysLT1受體的作用，孟魯司特是否也具有這種作用?另一方面，神經(jīng)元損傷受膠質(zhì)細(xì)胞等其他細(xì)胞的相互調(diào)節(jié)，孟魯司特是否影響膠質(zhì)細(xì)胞而調(diào)節(jié)神經(jīng)元缺血性損傷?針對(duì)這些問(wèn)題，本研究第二部分在大鼠原代神經(jīng)元培養(yǎng)和皮質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)中，驗(yàn)證孟魯司特在整體試驗(yàn)中的神經(jīng)保護(hù)作用；同時(shí)，探

5、討其神經(jīng)元保護(hù)作用環(huán)節(jié)、是否依賴CysLT1受體以及與膠質(zhì)細(xì)胞作用的關(guān)系。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：孟魯司特對(duì)小鼠和大鼠局灶性腦缺血慢性損傷的作用。
　　 目的：⑴在小鼠模型闡明孟魯司特對(duì)局灶性腦缺血慢性損傷的治療作用，并與普魯司特進(jìn)行比較。⑵在大鼠模型確定孟魯司特口服給藥，是否對(duì)慢性局灶性腦缺血損傷有保護(hù)作用，并與臨床有效的抗氧化藥依達(dá)拉奉(edaravone)進(jìn)行比較。
　　 方法：以大腦中動(dòng)脈阻

6、塞方法誘導(dǎo)局灶性腦缺血后，小鼠腹腔注射孟魯司特(0.01和0.1 mg/kg)，共5天；大鼠灌胃給予孟魯司特(0.1和0.5 mg/kg)，共5天。缺血后28天內(nèi)，觀察行為學(xué)異常以評(píng)價(jià)神經(jīng)功能損害，包括神經(jīng)癥狀評(píng)分、轉(zhuǎn)角試驗(yàn)(小鼠)和伸爪試驗(yàn)(大鼠)。28天后，觀察腦損傷體積、腦萎縮和神經(jīng)元缺失變化，以評(píng)估腦損傷改變。
　　 結(jié)果：孟魯司特(0.1 mg/kg)減輕小鼠局灶性腦缺血后的行為學(xué)異常、腦損傷體積、腦萎縮和神經(jīng)元缺失，

7、其作用與普魯司特(0.1 mg/kg)相似。大鼠經(jīng)口給予孟魯司特(0.5 mg/kg)也顯著減輕慢性損傷，其作用強(qiáng)于依達(dá)拉奉(10 mg/kg)；尤其對(duì)于提高伸爪試驗(yàn)成功率的作用較為明顯。但是，孟魯司特對(duì)于大鼠和小鼠腦缺血后的死亡率沒(méi)有作用，表明其不能對(duì)抗非常嚴(yán)重的腦缺血損害。
　　 結(jié)論：⑴CysLT1受體拮抗劑孟魯司特對(duì)小鼠局灶性腦缺血慢性損傷有保護(hù)作用，其有效劑量為0.1 mg/kg，與普魯司特作用基本相仿。⑵口服孟魯司特

8、對(duì)大鼠局灶性腦缺血慢性損傷也具有顯著的保護(hù)作用，對(duì)改善大鼠術(shù)后精細(xì)行為改變有較顯著的作用，其有效劑量為0.5 mg/kg。這些發(fā)現(xiàn)支持CysLT1受體拮抗劑治療缺血性腦卒中的潛在價(jià)值。
　　 第二部分：孟魯司特對(duì)神經(jīng)元缺血性損傷的作用。
　　 目的：⑴確認(rèn)孟魯司特對(duì)神經(jīng)元體外缺血性損傷有無(wú)保護(hù)作用；對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的損傷(腦缺血后繼發(fā)性出血損傷)是否有保護(hù)作用。⑵確認(rèn)孟魯司特對(duì)神經(jīng)元缺血性損傷的保護(hù)作用是否通過(guò)拮抗CysLT

9、1受體；與混合培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞有無(wú)作用。
　　 方法：在大鼠皮層神經(jīng)元及混合培養(yǎng)細(xì)胞，選擇OGD及恢復(fù)的最佳損傷條件(OGD2 h/R24 h，OGD/R)；以凝血酶(1.1～100 U/ml)誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷。損傷前以不同濃度孟魯司特及LTD4預(yù)處理。神經(jīng)元損傷以細(xì)胞存活率(MTT還原試驗(yàn))、LDH漏出率、凋亡率(Hoechst33258染色)、神經(jīng)元數(shù)量及形態(tài)加以評(píng)價(jià)；并觀察神經(jīng)元CysLT1受體表達(dá)(免疫染色)、活性氧(ROS

10、)產(chǎn)生、小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 結(jié)果：在神經(jīng)元，孟魯司特在0.01～10μM濃度范圍內(nèi)顯著保護(hù)OGD瓜誘導(dǎo)的缺血性損傷，減輕存活率降低、LDH漏出、凋亡率、神經(jīng)元數(shù)量減少及形態(tài)改變；孟魯司特對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷無(wú)保護(hù)作用。CysLT1受體激動(dòng)劑LTD4(1～100nM)對(duì)神經(jīng)元OGD/R損傷的有一定的保護(hù)作用，但兩藥(孟魯司特0.01μM+LTD41～100 nM)無(wú)協(xié)同作用。孟魯司特(0.01～10μM)能顯著抑制OG

11、D瓜誘導(dǎo)神經(jīng)元ROS的產(chǎn)生，但LTD4(10～1000 nM)無(wú)顯著作用。在混合培養(yǎng)細(xì)胞，孟魯司特(0.0001～1μM)顯著改變OGD/R后神經(jīng)元形態(tài)，但LTD4(0.1～1000 nM)基本無(wú)作用。孟魯司特(0.0001～0.01μM)和LTD4(1～1000 nM)顯著減少OGD/R誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，但兩藥(孟魯司特0.01μM1+LTD4100 nM)無(wú)協(xié)同或拮抗作用。
　　 結(jié)論：⑴孟魯司特對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元