凝溶膠蛋白在急性放射損傷防護(hù)中的作用.pdf

1、大腸癌是常見的消化道腫瘤之一，在我國(guó)大腸癌發(fā)病率逐年上升，在上海等大城市已與發(fā)達(dá)國(guó)家相近。然而，關(guān)于大腸癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。目前的研究普遍認(rèn)為大腸癌的發(fā)生是多因素、多步驟交互作用的結(jié)果，是在一系列基因損傷所致基因突變的誘導(dǎo)效應(yīng)下原癌基因的激活以及抑癌基因失活，繼而引發(fā)細(xì)胞的過度增殖和異常的程序性死亡所致。其中涉及多種關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶的改變，在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化之前，這種改變已經(jīng)在分子及代謝水平發(fā)生。許多細(xì)胞的癌變都與控制細(xì)胞增殖及凋亡

2、的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中某一環(huán)節(jié)的失調(diào)有關(guān)，最終表現(xiàn)為某個(gè)基因及其衍生通道的失調(diào)。最近從一些實(shí)驗(yàn)組中觀察到在腫瘤病人包掛大腸癌病人中L-精氨酸和L-瓜氨酸在循環(huán)中均有下降。體外的研究發(fā)現(xiàn)L-精氨酸(L-Arg)及其主要代謝產(chǎn)物——L-瓜氨酸(L-Cit)對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)都起著重要的作用。然而，在大腸癌組織細(xì)胞中L-精氨酸和L-瓜氨酸的水平以及分子調(diào)節(jié)機(jī)制卻未有研究報(bào)道。因此，明確L-精氨酸和L-瓜氨酸以及分子調(diào)節(jié)機(jī)制在大腸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，對(duì)揭示大

3、腸癌的發(fā)病原因及進(jìn)一步指導(dǎo)臨床診斷和治療，具有重要意義。
　　 本課題研究目的：
　　 大腸癌的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。目前的研究普遍認(rèn)為腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是復(fù)雜而有序的多階段生物學(xué)過程，受到多種酶的調(diào)控。大腸癌的發(fā)生是多因素、多步驟、內(nèi)外因交互作用的結(jié)果，是在一系列酶誘導(dǎo)下原癌基因的激活以及抑癌基因失活，繼而引發(fā)細(xì)胞的過度增殖和異常的程序性死亡所致。其外因包括物理、化學(xué)和生物致癌因素，內(nèi)因則涉及很多關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶的改變，在細(xì)胞

4、形態(tài)發(fā)生明顯變化之前，已經(jīng)在分子及代謝水平發(fā)生了異常的改變，因此明確大腸癌的代謝調(diào)節(jié)改變對(duì)進(jìn)一步預(yù)防大腸癌的發(fā)生及指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。
　　 在人體中，L-精氨酸不僅是合成蛋白質(zhì)的一種重要的原料，而且還在生理功能方面有著重要的作用，其在精子的發(fā)生，胚胎的發(fā)育，胎兒的生長(zhǎng)，和新生兒的成長(zhǎng)，血管緊張度的維持，細(xì)胞分裂、血流動(dòng)力學(xué)以及免疫功能等各個(gè)方面都扮演著重要的角色。初步的臨床研究觀察到，在腫瘤病人包括大腸癌病人中L-精氨酸

5、和L-瓜氨酸在循環(huán)中均有下降。但其在大腸癌組織細(xì)胞中L-精氨酸和L-瓜氨酸的含量水平卻未有研究報(bào)道。體外研究表明，L-精氨酸是腫瘤細(xì)胞生存必須的氨基酸，尤其是那些因?yàn)榫彼徵晁岷铣擅副磉_(dá)缺陷的腫瘤細(xì)胞，比如胰腺癌、肝癌、前列腺癌依賴于微環(huán)境中的L-精氨酸。本課題試圖集中于L-精氨酸的代謝途徑與大腸癌的發(fā)病機(jī)制中的關(guān)系，著手于以下三個(gè)方面進(jìn)行研究：
　　 首先，本課題采用了高效液相色譜法，對(duì)大腸癌病人的血清以及腫瘤組織中L-精氨

6、酸以及L-瓜氨酸進(jìn)行了分析。弄清L-精氨酸在大腸癌組織中的生物利用度。
　　 其次，本課題測(cè)定了影響細(xì)胞內(nèi)精氨酸合成的精氨酸琥珀酸合成酶在大腸癌細(xì)胞表達(dá)情況，從而弄清大腸癌腫瘤細(xì)胞調(diào)節(jié)精氨酸生物利用度的分子機(jī)制。
　　 最后，本課題進(jìn)一步探討了大腸癌腫瘤組織對(duì)精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制，即應(yīng)用定量PCR的方法檢測(cè)了調(diào)節(jié)精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 通過以上的深入研究，本課題從臨床基礎(chǔ)的角度探討大腸癌組織中精氨酸代

7、謝途徑的變化及其可能的大腸癌發(fā)生發(fā)展新的分子機(jī)理。這一新的研究方向，將有利于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的大腸癌診斷方法和分子靶向治療的新靶點(diǎn)，最終進(jìn)一步改善大腸癌的綜合診療效果。
　　 本課題研究方法：
　　 1.研究對(duì)象：
　　 取22位大腸癌病人。男12名，女10名，平均59±13歲，(年齡范圍于37至79歲)。所采集病例為2009年5月至2009年8月上海長(zhǎng)征醫(yī)院普通外科本研究組收治的大腸癌病人。其中包括5例乙狀結(jié)腸癌、

8、4例降結(jié)腸癌、6例直腸癌、5例升結(jié)腸癌、2例橫結(jié)腸癌。
　　 取共25例健康志愿者，男16例、女9例，平均年齡56±10歲，年齡39至74歲。性別與年齡與病例組對(duì)比，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差別。
　　 2.方法：空腹靜脈取血，收集血清樣品。血樣品處于4000×g離心10分鐘，血清置于-80℃直至用于分析。組織全部取材于大腸癌病人。手術(shù)中，切除腫瘤標(biāo)本的腫瘤部分和正常部分同時(shí)采取，組織置于-80℃直至用于分析。
　　 第一

9、部分：L-精氨酸以及L-瓜氨酸的測(cè)定
　　 取200μl血清與80μL三氯乙酸(0.1 g/mL)混合，置于75-80℃下15分鐘，之后以10,000×g離心15分鐘，上層清液置于另一試管中并且與100μL異硫氰酸苯酯(含甲醇、乙醇、三乙胺、超純水)衍生化反應(yīng)物，置于室溫下反應(yīng)20分鐘，衍生化之后，將混合物冷凍干燥加入流動(dòng)相A，再將分解液濾過，取20μl進(jìn)行高效液相色譜法(HPLC)分析。腫瘤組織和腫瘤的正常組織部分被精確稱量，

10、并且每0.1的組織都在冰浴條件下經(jīng)過與三氯乙酸充分溶解。組織勻漿溶解液離心后取上清，接下來的操作同血清樣本。
　　 腫瘤組織和血清中的L-精氨酸以及L-瓜氨酸的含量由反相高效液相色譜法經(jīng)紫外線測(cè)定。分析物的成分及含量從標(biāo)準(zhǔn)樣本所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線中進(jìn)行回歸分析計(jì)算。血清和組織中的L-精氨酸以及L-瓜氨酸含量分別以μmol/L和μg/g表達(dá)。應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較采用Student's t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義。
　　 第二部分：精氨酸琥珀酸合成酶在大腸癌組織表達(dá)的測(cè)定
　　 取組織制成4μm的石蠟切片，然后經(jīng)脫蠟、水洗、抗原修復(fù)、羊血清封閉后滴加抗人精氨酸琥珀酸合成酶的第一抗體1小時(shí)/4攝氏度冰箱過夜。再用PBS沖洗后，滴加相應(yīng)的酶標(biāo)二抗EvisvisionTM在37攝氏度培育40分鐘，進(jìn)而DAB顯色3-10分鐘或顯微鏡下觀察染色效果。
　　 所取腫瘤病人的腫瘤組織以及正常組織殘端進(jìn)行免疫組化以及蛋白印記檢測(cè)

12、來比較精氨酸琥珀酸合成酶在病理和生理狀態(tài)下的表達(dá)情況。
　　 第三部分：定量PCR檢測(cè)精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)
　　 取約100mg組織放于玻璃研磨器內(nèi)，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨組織后，再加氯仿并離心。上層水相進(jìn)一步加入異丙醇沉淀并洗脫RNA。提取的RNA保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。
　　 提取的RNA用SSIII逆轉(zhuǎn)錄酶/AMV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后立即應(yīng)用Thermal

13、 Cycler DiceTM Real Time System擴(kuò)增儀進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)應(yīng)用SYBR(R) Premix Ex TaqTM。內(nèi)參為GPDH。比較腫瘤組織與正常大腸組織測(cè)定結(jié)果。本課題測(cè)定了與精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的CAT-1，CAT-2等八個(gè)基因在腫瘤組織中與正常組織中的表達(dá)情況。
　　 本課題主要結(jié)果：
　　 一、對(duì)大腸癌患者和正常人血清中的L-精氨酸和L-瓜氨酸的濃度測(cè)定結(jié)果表明，大腸癌病人中兩者的血

14、清濃度均要低于正常人。與對(duì)照組比，22位大腸癌病人的血清L-精氨酸和L-瓜氨酸濃度均明顯減少(分別是P＜0.01和P＜0.001)。L-瓜氨酸在血清中的濃度下降要比L-精氨酸下降的多，造成了在病人血清中L-瓜氨酸/L-精氨酸的比率低于正常對(duì)照組P＜0.05。
　　 測(cè)量腫瘤組織中的L-精氨酸和L-瓜氨酸的含量，發(fā)現(xiàn)同一個(gè)病人中，L-精氨酸和L-瓜氨酸在大腸癌腫瘤組織的濃度水平要高于其在正常殘端的兩倍。在22位大腸癌病人組織中，這

15、個(gè)結(jié)果具有重復(fù)性。同一病人中，大腸癌灶組織中L-精氨酸和L-瓜氨酸的濃度要顯著高于正常組織中的L-精氨酸和L-瓜氨酸的濃度(P＜0.005和P＜0.01同等)。然而，大腸癌與正常組織中L-瓜氨酸/L-精氨酸比率沒有顯著差異，表明大腸癌細(xì)胞和正常大腸上皮細(xì)胞對(duì)L-瓜氨酸/L-精氨酸的代謝途徑是相同的。
　　 二、通過免疫組化以及蛋白印記，發(fā)現(xiàn)：大腸癌組織中調(diào)節(jié)L-精氨酸和L-瓜氨酸含量的精氨酸琥珀酸酶的表達(dá)明顯高于其在正常組織的表

16、達(dá)。
　　 三、通過應(yīng)用螢光定量PCR測(cè)定精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)八個(gè)基因在大腸癌病人腫瘤組織以及正常殘端的的表達(dá)譜不一，其中SLC7A22A基因表達(dá)異常增高，SLC7A2、2B、SLC7A4、SLC3A2、SLC7A6、SLC6A14基因表達(dá)異常降低，且具有顯著差異。本課題主要結(jié)論：
　　 1.大腸癌患者血清中L-精氨酸和L-瓜氨酸的含量較正常人低，而大腸癌患者的腫瘤組織中L-精氨酸和L-瓜氨酸的含量較其在大腸癌