泛素連接酶Cbl家族調(diào)控乳腺癌內(nèi)分泌治療與分子靶向治療敏感性的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,內(nèi)分泌治療和分子靶向治療是乳腺癌的兩個(gè)重要治療手段。他莫昔芬(tamoxifen,TAM)是雌激素受體拮抗劑,是乳腺癌內(nèi)分泌治療的一線用藥,腫瘤壞死因子相關(guān)調(diào)亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是一種具有潛在林床應(yīng)用價(jià)值的靶向生物制劑(Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段)。臨床上大部分患者在應(yīng)用TAM一段時(shí)間后發(fā)生繼發(fā)耐藥,大部分乳腺癌

2、細(xì)胞對(duì)TRAIL原發(fā)性耐藥。研究TAM及TRAIL的耐藥機(jī)制,探索逆轉(zhuǎn)耐藥的新措施可為乳腺癌的內(nèi)分泌及分子靶向治療提供理論依據(jù)。
　　 TAM主要通過競爭性與雌激素受體(estrogen receptor,ER)結(jié)合,從而拮抗雌激素,抑制ER陽性乳腺癌細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)分泌治療藥物的敏感性與細(xì)胞存活通路的活性密切相關(guān),HER-2等細(xì)胞膜生長因子受體過表達(dá)后可通過活化細(xì)胞內(nèi)的存活通路導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)TAM耐藥,抑制細(xì)胞內(nèi)存

3、活通路的活性可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)TAM的敏感性。最近研究發(fā)現(xiàn)TAM可以通過ER非依賴的途徑誘導(dǎo)ER陽性及陰性的腫瘤細(xì)胞凋亡,但是TAM誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞存活通路所發(fā)揮的作用尚不明確。本課題的第一部分將主要研究細(xì)胞存活通路在TAM誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡過程中所發(fā)揮的作用。
　　 TRAIL通過與細(xì)胞膜上的死亡受體4(death receptor,DR)和死亡受體5(DR5)結(jié)合導(dǎo)致死亡受體通路起始因子Caspase-8的活化,

4、最終導(dǎo)致死亡底物PARP等的裂解,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。既往研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞DR4/DR5的表達(dá)普遍較低或缺失,副作用較大的化療藥物,如表阿霉素、紫杉醇、順鉑等可通過上調(diào)死亡受體的表達(dá)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性,但是副作用比較小的中藥增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL敏感性影響的報(bào)道尚少。本課題第二部分選擇傳統(tǒng)中藥蟾酥的有效成分蟾蜍靈(Bufalin),研究其對(duì)DR4/DR5的表達(dá)及乳腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性的影響。
　　 泛素蛋白

5、酶體途徑是真核細(xì)胞內(nèi)選擇性降解蛋白質(zhì)的重要途徑。c-Cb1和Cb1-b是Cb1家族研究比較廣泛的E3泛素連接酶,它們可以通過特異性選擇底物蛋白啟動(dòng)泛素化降解途徑,參與膜受體表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路活性的負(fù)性調(diào)節(jié)。本課題以乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞為模型,研究Cb1家族對(duì)細(xì)胞存活通路活性及TAM敏感性的調(diào)節(jié),以MCF-7和MDA-MB-231為模型研究Cb1家族對(duì)死亡受體表達(dá)的調(diào)節(jié)及對(duì)TRAIL敏感性的調(diào)控。
　　 材料與方法：

6、　　 1.采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,繪制細(xì)胞增殖曲線。
　　 2.采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜表面DR4/DR5的表達(dá),PI單染法進(jìn)行細(xì)胞周期分析、凋亡判定。
　　 3.采用Western blot檢測(cè)c-Cbl、Cbl-b、ERK、AKT、JNK、p38、DR4、DR5等蛋白的表達(dá)。
　　 4.采用RT-PCR方法檢測(cè)DR4/DR5的mRNA表達(dá)水平。
　　 5.采用LipofectaminTAM 200

7、0試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,兩組間差異采用t檢驗(yàn),P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、TAM抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡
　　 TAM以時(shí)間和劑量依賴的方式抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖,24h、48h細(xì)胞增殖抑制率達(dá)50%的藥物濃度(IC50)分別為23.6±1.2μM和14.4±1.1μM。流式分析

8、顯示5μM的TAM作用于MCF-7細(xì)胞24h后僅有4.1%的細(xì)胞凋亡,25μM的TAM作用于MCF-7細(xì)胞16h和24h后,分別有10.2%和20.1%的細(xì)胞凋亡,提示TAM以時(shí)間及劑量依賴方式誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。
　　 2、TAM對(duì)細(xì)胞存活信號(hào)活性的影響及細(xì)胞存活信號(hào)在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮的作用。
　　 以誘導(dǎo)MCF-7發(fā)生明顯凋亡的TAM濃度(25μM)作用于細(xì)胞不同時(shí)間后檢測(cè)c-Src、Akt、ERK的表達(dá)及活性

9、的變化。Western blot分析結(jié)果顯示MCF-7細(xì)胞內(nèi)有一定程度的基礎(chǔ)c-Src活性,在TAM作用16h和24h后c-Src的活性被抑制,表達(dá)水平被下調(diào)。TAM可誘導(dǎo)ERK的快速且持續(xù)的活化。TAM作用3h后AKT出現(xiàn)活化,24h后降至基礎(chǔ)水平以下。分別用10μM的PP2(c-Src特異性抑制劑),20μM的PD98059(ERK特異性抑制劑),10μM的LY294002(AKT特異性抑制劑)預(yù)處理1h后,給予25μM的TAM作用

10、24h,流式分析顯示,細(xì)胞的凋亡由20.1%分別上升至40.67%、45.88%和51.4%,提示c-Src、ERK和AKT在TAM誘導(dǎo)凋亡過程中發(fā)揮了保護(hù)性作用。
　　 3、乳腺癌細(xì)胞對(duì)靶向藥物TRAIL的敏感性及Bufalin對(duì)TRAIL敏感性的影響
　　 在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中,100ng/mL的TRAIL誘導(dǎo)＜7%的細(xì)胞凋亡。MTT結(jié)果顯示Bufalin以時(shí)間和劑量依賴的方式抑制MCF-7和MD

11、A-MB-231細(xì)胞增殖,MCF-7細(xì)胞24h和48h的IC50分別是317.9±1.5nM和46.5±1.4nM,MDA-MB-231細(xì)胞24h和48h的IC50分別是934.1±2.0nM和513.3±1.6nM,結(jié)果提示MCF-7細(xì)胞比MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)Bufalin的敏感性高,因此我們選擇MCF-7細(xì)胞48h的IC50附近濃度(50nM)檢測(cè)Bufalin對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的影響。流式分析結(jié)果顯示50nM的Bufali

12、n作用24h主要誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2M期阻滯,僅誘導(dǎo)4～10%的細(xì)胞發(fā)生凋亡。Bufalin與TRAIL聯(lián)合作用24h可誘導(dǎo)30.1%的MCF-7細(xì)胞凋亡,41.5%的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡,提示雖然不同的乳腺癌細(xì)胞系對(duì)Bufalin敏感性差異很大,但是低濃度的Bufalin均可增強(qiáng)它們對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性。
　　 4、死亡受體表達(dá)的上調(diào)介導(dǎo)了Bufalin對(duì)TRAIL的增敏作用
　　 為明確Bufalin增強(qiáng)

13、TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制,我們檢測(cè)了兩藥聯(lián)合作用后死亡受體凋亡通路活性的變化情況。Western blot分析結(jié)果顯示,兩藥聯(lián)合作用后可明顯活化死亡受體凋亡通路的啟動(dòng)因子Caspase-8及死亡底物PARP。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Bufalin作用后可在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)DR4和DR5蛋白及mRNA。采用siRNA抑制Bufalin對(duì)DR4和DR5的上調(diào)后,部分逆轉(zhuǎn)了Bufalin與TRAIL誘導(dǎo)的凋亡,結(jié)果提示D

14、R4和DR5的上調(diào),部分介導(dǎo)了Bufalin增強(qiáng)TRAIL敏感性的過程。
　　 5、死亡受體表達(dá)的調(diào)控機(jī)制
　　 為研究Bufalin上調(diào)死亡受體DR4/DR5的機(jī)制,我們?cè)贛DA-MB-231細(xì)胞上檢測(cè)了Bufalin作用后ERK、JNK、p38活性的變化。Western blot分析結(jié)果顯示,Bufalin可誘導(dǎo)ERK、JNK和p38的活化。分別用ERK、JNK和p38特異性的抑制劑預(yù)處理2.5h后給予Bufalin

15、,結(jié)果DR4/DR5的上調(diào)被逆轉(zhuǎn),同時(shí)Bufalin和TRAIL誘導(dǎo)的凋亡也被部分逆轉(zhuǎn),結(jié)果提示ERK、JNK和p38的活化導(dǎo)致了DR4/DR5的上調(diào)。
　　 6、Cb1家族對(duì)TAM、Bufalin/TRAIL誘導(dǎo)凋亡的調(diào)控
　　 Western blot分析顯示TAM作用于MCF-7細(xì)胞后c-Cb1的表達(dá)上調(diào)。采用LipofectamineTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染野生型c-Cbl和c-Cbl的負(fù)性突變體70Z/Cbl后,流

16、式分析結(jié)果顯示“過表達(dá)”c-Cb1后,細(xì)胞對(duì)TAM的敏感性上調(diào)。70Z/Cb1抑制c-Cb1的泛素連接酶功能后細(xì)胞對(duì)TAM的敏感性下調(diào)。在Bufalin作用于MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞后,Western blot分析顯示c-Cb1的表達(dá)水平未見明顯變化,Cb1-b的表達(dá)水平逐漸下調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)“沉默”Cb1-b的表達(dá)后,細(xì)胞對(duì)Bufalin與TRAIL聯(lián)合誘導(dǎo)凋亡的敏感性明顯上調(diào)。以上結(jié)果提示Bufalin通過下調(diào)Cb1-

17、b的表達(dá)增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。
　　 7、Cb1家族調(diào)控TAM及Bufalin/TRAIL誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制
　　 為探討c-Cb1調(diào)節(jié)MCF-7細(xì)胞對(duì)TAM敏感性的機(jī)制,我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)染野生型c-Cb1及其負(fù)突變體70Z/Cb1后細(xì)胞存活通路的變化。Western blot分析顯示,上調(diào)c-Cb1的表達(dá)水平可明顯抑制基礎(chǔ)及TAM誘導(dǎo)的c-Src、ERK、AKT的活性,抑制c-Cb1的泛素連接酶功能可解除對(duì)c-S

18、rc、ERK、AKT活性的抑制作用。
　　 為探討B(tài)ufalin作用后DR4/DR5表達(dá)變化的機(jī)制,我們檢測(cè)了“沉默”Cb1-b后DR4/DR5表達(dá)的變化。Western blot分析顯示“沉默”Cb1-b后提高了Bufalin誘導(dǎo)的DR4/DR5上調(diào)幅度,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Cbl-b的下調(diào)解除了其對(duì)ERK、JNK、p38活性的抑制,進(jìn)而導(dǎo)致了DR4/DR5上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.TAM以時(shí)間和劑量依賴的方式

19、抑制乳腺癌MCF-7增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 2.c-Sre、ERK及AKT在TAM誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了保護(hù)性作用。
　　 3.乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞均對(duì)TRAIL耐藥,Bufalin可明顯增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL敏感性。
　　 4.Bufalin通過上調(diào)死亡受體DR4/DR5的表達(dá)水平增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。
　　 5.Bufalin通過活化MAPKs(