人E-鈣粘素融合蛋白基質(zhì)構(gòu)建干細(xì)胞微環(huán)境的研究.pdf

1、細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系，細(xì)胞表面的受體與細(xì)胞外微環(huán)境相互作用，決定了細(xì)胞的粘附、增殖、遷移、分化，以及特異性功能表達(dá)。近年來，組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究取得了重要的進(jìn)展，為各領(lǐng)域的研究拓寬了一條新的途徑。利用生物材料、醫(yī)用材料等仿生構(gòu)建細(xì)胞外微環(huán)境的應(yīng)用已經(jīng)成為生物材料領(lǐng)域研究的重點(diǎn)，其中，以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的新型生物材料---融合蛋白的研制已成為設(shè)計(jì)和構(gòu)建細(xì)胞外微環(huán)境生物材料研究的新方向。本論文通過生物合成人

2、E-鈣粘素融合蛋白，研究開發(fā)仿生細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用的生物材料，并仿生構(gòu)建細(xì)胞外微環(huán)境調(diào)控細(xì)胞行為，其不僅能有效推動(dòng)基礎(chǔ)生物學(xué)的研究，同時(shí)在組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用。
　　首先，我們重組了人細(xì)胞間粘附分子E-鈣粘蛋白(hE-cadherin)的胞外域與免疫球蛋白G(IgG)的Fc域，生物合成人E-鈣粘素融合蛋白(hE-cadherin-Fc)。基因工程技術(shù)構(gòu)建了融合蛋白表達(dá)載體，利用293F細(xì)胞表達(dá)體系進(jìn)行了融合蛋白

3、的表達(dá)并純化，Elisa和westernblotting檢測表明我們成功制備了高純度的hE-cadherin-Fc。進(jìn)一步將融合蛋白應(yīng)用于疏水材料的表面修飾，仿生構(gòu)建了細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用的生物材料細(xì)胞外微環(huán)境并用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)的增殖及定向分化研究。接觸角(WCA)及原子力顯微鏡(AFM)檢測表明:hE-cadherin-Fc能夠利用Fc結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定的吸附在疏水材料表面，同時(shí)改善了材料表面的形態(tài)及親水性，形成穩(wěn)定的細(xì)胞

4、外基質(zhì)。與組織細(xì)胞培養(yǎng)板(TC-PS)和明膠(Gelatin)基質(zhì)相比，hE-cadherin-Fc基質(zhì)能顯著增強(qiáng)hMSCs的粘附，并促進(jìn)細(xì)胞增殖;同時(shí)未分化性標(biāo)志物CD105的流式細(xì)胞術(shù)鑒定顯示:hMSCs保持了良好的未分化性。hE-cadherin-Fc基質(zhì)對hMSCs生物學(xué)行為的調(diào)控及其分子機(jī)制的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)融合蛋白基質(zhì)顯著提高了E鈣粘素信號通路的相關(guān)分子表達(dá)水平，初步揭示了在細(xì)胞培養(yǎng)初期hE-cadherin-Fc基質(zhì)與細(xì)胞

5、間的相互作用代替了細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用。
　　其次，我們考察了hE-cadherin-Fc基質(zhì)對hMSCs向肝細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的影響。在hE-cadherin-Fc基質(zhì)表面hMSCs向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)4周后，細(xì)胞形態(tài)、肝特異性標(biāo)志物基因和蛋白的表達(dá)、肝細(xì)胞分化功能表達(dá)的檢測表明:不同基質(zhì)條件下hMSCs均有部分細(xì)胞分化成為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，與TC-PS和Gelatin基質(zhì)相比，hE-cadherin-Fc基質(zhì)表面分化的肝細(xì)胞樣細(xì)胞

6、表達(dá)肝前體細(xì)胞標(biāo)志物CD117的陽性細(xì)胞比例高于TC-PS和Gelatin基質(zhì)表面，并且肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物基因白蛋白(ALB)、細(xì)胞角蛋白18(CK18)和肝細(xì)胞核因子4（HNF4）的分子水平表達(dá)量更高;ALB蛋白免疫熒光染色結(jié)果也證明了ALB蛋白表達(dá)與其分子表達(dá)水平相同的結(jié)果。同時(shí)，肝分化功能指標(biāo)糖原儲(chǔ)存、吲哚青綠(ICG)攝取、白蛋白和尿素分泌的檢測結(jié)果表明，hE-cadherin-Fc基質(zhì)顯著提高了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源肝樣細(xì)胞分化

7、功能的表達(dá)。本研究結(jié)果表明hE-cadherin-Fc基質(zhì)與相關(guān)液性因子協(xié)同作用促進(jìn)hMSCs向肝細(xì)胞定向跨胚層分化的潛能，其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究，揭示了生物材料設(shè)計(jì)對其生物學(xué)功能的影響及應(yīng)用前景。
　　最后，我們進(jìn)一步探索了hE-cadherin-Fc用于納米纖維支架和多孔支架的生物功能改性的研究。掃描電子顯微鏡(SEM)的結(jié)果顯示，融合蛋白的修飾沒有改變支架的三維微納米結(jié)構(gòu)。X射線光電子能譜(XPS)和Elisa檢測結(jié)

8、果表明，hE-cadherin-Fc在三維支架表面有效形成了穩(wěn)定的融合蛋白層。WCA結(jié)果顯示hE-cadherin-Fc表面修飾顯著改善了三維支架表面的親水性;同時(shí)，hE-cadherin-Fc基質(zhì)化提高了hMSCs在三維支架上的粘附與增殖。細(xì)胞骨架染色和細(xì)胞形態(tài)結(jié)果表明，在hE-cadherin-Fc表面改性支架內(nèi)的細(xì)胞更接近成纖維狀。此外，茜素紅染色表明hE-cadherin-Fc基質(zhì)表面擴(kuò)增的干細(xì)胞保持了良好的分化性能。本研究表明