血必凈對OVA誘導的變應(yīng)性鼻炎小鼠的治療作用及其對HO-1的影響.pdf

1、目的:
　　 變應(yīng)性鼻炎(Allergicrhinitis，AR)是易感個體接觸變應(yīng)原后，主要由免疫球蛋白E介導的以發(fā)作性噴嚏、流涕和鼻塞為主要癥狀的鼻黏膜變態(tài)反應(yīng)性炎癥。表現(xiàn)為大量表達Th2細胞因子的Th細胞、嗜酸粒細胞和肥大細胞浸潤，同時引發(fā)炎性反應(yīng)過程[1]。近50年來變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，作為難治性疾病，它已成為一個全球性健康問題。由于疾病發(fā)生的原因復雜且參與因素眾多，因此以FVB小鼠為研究對象建立變應(yīng)性鼻

2、炎小鼠模型，以小鼠鼻黏膜下毛細血管內(nèi)皮細胞為切入點研究血必凈治療前后鼻黏膜和毛細血管內(nèi)皮中HO-1的表達情況，探討血必凈對OVA誘導的變應(yīng)性鼻炎小鼠的治療作用及其對HO-1的影響，為變應(yīng)性鼻炎的治療提供一個新的思路。
　　 方法:
　　 FVB系SPF級小鼠40只，隨機分為正常對照組、OVA模型組、OVA+地塞米松干預組和OVA+血必凈干預組，每組10只。OVA模型組:卵清蛋白(OVA)1.5ml加入氫氧化鋁1.5ml，

3、制成10％OVA混懸液。于實驗第1～9天，經(jīng)腹腔注射OVA混懸液250μl(OVA25μg)，基礎(chǔ)致敏完成后于實驗第10～17天行局部激發(fā)。OVA+地塞米松干預組、OVA+血必凈干預組模型建立:實驗第1～9天，經(jīng)腹腔注射OVA混懸液250μl(OVA25μg)，基礎(chǔ)致敏完成后，實驗10～17天地塞米松(10mg/kg/d)或血必凈(0.41ml/kg/d)腹腔注射預處理，30min后局部激發(fā)，建立模型。動物模型進行行為學觀察。HE染色觀

4、察鼻部形態(tài)學改變。鼻腔灌洗液離心沉淀涂片行炎性細胞計數(shù)。酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測外周血中OVA特異性IgE和鼻腔灌洗液IL-4、IL-5、IL-13、INF-γ水平。免疫組織化學染色觀察鼻黏膜HO-1的表達情況。采用免疫磁珠技術(shù)對正常小鼠分離鼻黏膜下毛細血管內(nèi)皮細胞，傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)于20％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，依照實驗建立正常對照組、炎癥模型組、血必凈干預組、TNF+地塞米松干預組、TNF+血必凈干預組、Znpp+T

5、NF+血必凈干預組。Westernblot、Real-timePCR技術(shù)檢測毛細血管內(nèi)皮細胞HO-1、ICAM-1表達情況，激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測ROS的表達。所有資料均運用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析，采用方差分析和相關(guān)分析處理數(shù)據(jù)，以α=0.05作為檢驗標準，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:
　　 OVA模型組中10只動物均建模成功，變應(yīng)性鼻炎典型癥狀明顯;OVA+地塞米松干預組、OVA+血必凈干預

6、組相比正常對照組癥狀無明顯變化。
　　 1、HE染色形態(tài)學觀察:正常對照組鼻黏膜無明顯炎癥改變;OVA模型組鼻黏膜則有不同程度的水腫，上皮細胞結(jié)構(gòu)紊亂，杯狀細胞增生，黏膜下嗜酸粒細胞、中性粒細胞、單核細胞浸潤;而OVA+地塞米松干預組、OVA+血必凈干預組上述癥狀明顯減輕。血清OVA特異性IgE水平ELISA檢測:OVA模型組中的OVA特異性IgE水平相比正常對照組明顯升高，而OVA+地塞米松干預組、OVA+血必凈干預組相比OV

7、A模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）;鼻腔灌洗液離心沉淀涂片行炎性細胞計數(shù):OVA模型組中的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞相比正常對照組明顯升高，而OVA+地塞米松干預組、OVA+血必凈干預組相比OVA模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。證明血必凈對OVA誘導的變應(yīng)性鼻炎小鼠有治療作用。
　　 2、鼻腔灌洗液IL-4、IL-5、IL-13、INF-γ水平ELISA檢測:OVA模型組中的IL-4、IL-5、I

8、L-13水平相比正常對照組明顯升高，而OVA+地塞米松干預組、OVA+血必凈干預組相比OVA模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）;相反OVA模型組中的INF-γ相比正常對照組明顯降低，而OVA+地塞米松干預組、OVA+血必凈干預組相比OVA模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明血必凈通過調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡，從而治療OVA誘導的變應(yīng)性鼻炎小鼠。
　　 3、ROS與CAT、GSH、SOD的檢測:ROS

9、激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測顯示:ROS在TNF+地塞米松干預組、TNF+血必凈干預組相比炎癥模型組在毛細血管內(nèi)皮細胞明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。SOD、CAT、GSH在TNF+血必凈干預組相比炎癥模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明血必凈通過逆轉(zhuǎn)氧化/抗氧化失衡，從而治療OVA誘導的變應(yīng)性鼻炎小鼠。
　　 4、Westernblot結(jié)果顯示:相比炎癥模型組，TNF+血必凈干預毛細血管內(nèi)皮細

10、胞后，ICAM-1表達減少。單核細胞粘附:TNF+地塞米松干預組、TNF+血必凈干預組相比炎癥模型組毛細血管內(nèi)皮細胞粘附單核細胞明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。說明血必凈通過調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡、逆轉(zhuǎn)氧化/抗氧化失衡，抑制鼻黏膜下毛細血管內(nèi)皮細胞活化，從而治療OVA誘導的變應(yīng)性鼻炎小鼠。
　　 5、免疫組化結(jié)果顯示:OVA模型組鼠鼻黏膜中HO-1主要位于黏膜上皮細胞和腺上皮細胞的胞漿，少見于胞核，間質(zhì)血管內(nèi)皮細胞和

11、浸潤的炎細胞胞漿中也有陽性著色表達，陽性表達為棕黃色顆粒。OVA模型組、OVA+地塞米松干預組、OVA+血必凈干預組與正常對照組相比，HO-1表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。HO活力檢測:血必凈干預組、TNF+血必凈干預組相比炎癥模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。Westernblot結(jié)果顯示:血必凈干預毛細血管內(nèi)皮細胞后，HO-1表達呈現(xiàn)劑量依賴性和時間依賴性;TNF-α刺激毛細血管內(nèi)皮細胞后，HO-1

12、表達呈現(xiàn)先升高再降低(4h表達最強);而TNE+血必凈干預毛細血管內(nèi)皮細胞后，HO-1長時間高表達。相比炎癥模型組，TNF+血必凈干預毛細血管內(nèi)皮細胞后，ICAM-1表達減少。Znpp是HO-1的阻斷劑，Znpp阻斷毛細血管內(nèi)皮細胞HO-1后，ICAM-1表達仍明顯增加。SOD、CAT、GSH在Znpp+TNF+血必凈干預組相比TNF+血必凈干預組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明血必凈通過誘導鼻黏膜下毛細血管內(nèi)皮細胞HO

13、-1的表達，其表達呈劑量依賴性和時間依賴性，調(diào)節(jié)Th1/Th2、氧化/抗氧化失衡，治療OVA誘導的變應(yīng)性鼻炎小鼠。
　　 結(jié)論:
　　 1、血必凈對OVA誘導的變應(yīng)性鼻炎小鼠的有治療作用。
　　 2、血必凈通過調(diào)節(jié)Th1/Th2、氧化/抗氧化失衡，抑制黏膜下毛細血管內(nèi)皮活化，從而治療OVA誘導的變應(yīng)性鼻炎小鼠。
　　 3、血必凈通過誘導鼻黏膜下毛細血管內(nèi)皮細胞HO-1的表達，其表達呈劑量依賴性和時間依賴性