免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜篩選肝核因子HNF3β相互作用蛋白質(zhì)及初步功能研究.pdf

1、肝細(xì)胞核因子HNF3β是一類在肝臟中富集表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控多種肝臟基因的組織特異性表達(dá),參與維持肝臟正常的表型與生理功能。敲除HNF3β的小鼠不能形成正常的神經(jīng)脊索并早期胚胎致死, HNF3β的變異可能與2型糖尿病的發(fā)生相關(guān)。HNF3β參與糖代謝、脂肪代謝、調(diào)控膽酸以及生長相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。HNF3β在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的過程中需要募集多種輔助因子協(xié)同發(fā)揮作用。對HNF3β相互作用蛋白質(zhì)的挖掘研究,有助于更深入的探索HNF3β在生命過程中

2、的功能及作用機(jī)制。目前有關(guān)HNF3β蛋白質(zhì)間相互作用的報(bào)道還相對較少,已知的與HNF3β發(fā)揮相互作用的蛋白質(zhì)只有8個(gè),包括OTX2,SRC1,TLE1,HOXA5,HNF6A,GSC,EN2,LHX1等,它們都參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這些數(shù)據(jù)對于全面的闡明HNF3β蛋白復(fù)合體的組成及動態(tài)變化還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。目前大規(guī)模研究蛋白質(zhì)間相互作用的方法主要有酵母雙雜交技術(shù),但由于要去除轉(zhuǎn)錄激活區(qū),因此并不適用于研究轉(zhuǎn)錄因子。免疫共沉淀技術(shù)可用于研究生理水平

3、下蛋白質(zhì)間的相互作用,隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,其準(zhǔn)確性高與速度快的優(yōu)點(diǎn)使免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于尋找生理水平下新的相互作用。
　　本研究對HNF3β相互作用蛋白質(zhì)進(jìn)行了分離鑒定,并對LMNA-HNF3β相互作用介導(dǎo)的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步的研究。以HNF3β特異抗體免疫沉淀分離HepG2細(xì)胞內(nèi)HNF3β蛋白質(zhì)復(fù)合體,SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)染色,切取與對照組存在差異的條帶進(jìn)行SDS-PAGE膠上蛋白質(zhì)LTQ質(zhì)譜鑒

4、定其組成成分。本文通過4次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)共獲得53個(gè)相互作用數(shù)據(jù),生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),其中與HNF3β共定位的蛋白質(zhì)有9個(gè),具有相互作用結(jié)構(gòu)域的的蛋白質(zhì)有5個(gè),有10個(gè)分子同靶蛋白具有相同GO注釋,有9個(gè)分子與靶蛋白之間存在間接相互作用。基于這些分析結(jié)果,挑選其中4個(gè)相互作用分子,構(gòu)建真核表達(dá)載體,進(jìn)行報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和外源性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。驗(yàn)證了LMNA與HNF3β的相互作用,報(bào)道基因?qū)嶒?yàn)表明LMNA可以影響 HNF3β的轉(zhuǎn)錄活性。免