重度子癇前期患者的血漿代謝組學(xué)研究.pdf

1、子癇前期(preeclampsia)伴有全身多臟器的損害，嚴(yán)重患者可因產(chǎn)后出血、腦出血、心功能衰竭、肺水腫、彌漫性血管內(nèi)出血而死亡，引起胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限和早產(chǎn)。在世界范圍內(nèi)大約10％妊娠婦女血壓升高，2％-8％妊娠婦女合并子癇前期，10％-15％孕產(chǎn)婦直接死亡原因和子癇前期、子癇有關(guān)。
　　 關(guān)于子癇前期的發(fā)病機(jī)制存在很多學(xué)說(shuō)卻無(wú)統(tǒng)一定論。近年大量研究證據(jù)支持這樣一個(gè)病因假說(shuō)，即母體血管系統(tǒng)和早期胎盤不相容，免疫介導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞侵

2、蝕胎盤螺旋動(dòng)脈，導(dǎo)致胎盤淺著床，血流灌注不足和缺氧，使得胎盤分泌一些毒性因子（如激素和代謝小分子）進(jìn)入母體循環(huán)，從而活化血管內(nèi)皮，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的廣泛改變和全身系統(tǒng)血管收縮，出現(xiàn)子癇前期臨床癥狀。目前已知的與疾病發(fā)生相關(guān)的循環(huán)因子包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胎盤生長(zhǎng)因子等，有學(xué)者對(duì)這些因子預(yù)測(cè)妊娠期高血壓疾病發(fā)病的能力進(jìn)行研究，遺憾的是這些已知的循環(huán)因子并不能很好的預(yù)測(cè)疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此近年來(lái)人們希望通過(guò)組學(xué)技術(shù)尋找和發(fā)現(xiàn)循環(huán)中生物

3、標(biāo)記物，來(lái)預(yù)測(cè)疾病發(fā)生，判定疾病發(fā)展程度，盡早的給予合理預(yù)防和目標(biāo)靶向治療，這對(duì)于臨床診斷和治療子癇前期、降低孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡率具有重要意義。
　　 代謝組學(xué)是組學(xué)技術(shù)的一種，可以概括為應(yīng)用高通量、高分辨、高靈敏度的分析手段，定性定量研究生物體體液中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物即代謝組，結(jié)合模式識(shí)別等化學(xué)信息學(xué)技術(shù)，分析生物體在不同狀態(tài)下的代謝指紋圖譜的差異，獲得相應(yīng)的生物標(biāo)志物群，跟蹤其代謝路徑，從而揭示生物體在特定時(shí)間、環(huán)境下的整體功

4、能狀態(tài)。鑒于代謝組學(xué)技術(shù)可以獲得生物標(biāo)記物群，預(yù)測(cè)疾病發(fā)生，判定疾病發(fā)展程度，進(jìn)行目標(biāo)靶向治療，英國(guó)學(xué)者利用基于氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的代謝組學(xué)技術(shù)研究子癇前期患者血漿代謝輪廓，分析代謝圖譜的差異尋找代謝生物標(biāo)記物群檢測(cè)子癇前期，這個(gè)研究初步將代謝組學(xué)的研究方法應(yīng)用于子癇前期，但是由于該實(shí)驗(yàn)選擇氣相色譜為分析分離手段，前期預(yù)處理過(guò)程較復(fù)雜，重復(fù)性低，花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，可能造成代謝產(chǎn)物丟失，且沒有提供代謝生物標(biāo)記物的結(jié)構(gòu)信息，其生物標(biāo)記物檢測(cè)子癇前

5、期的敏感性和特異性有待提高。
　　 本課題選擇基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜為分析分離手段的代謝組學(xué)技術(shù)，結(jié)合化學(xué)信息學(xué)技術(shù)，檢測(cè)重度子癇前期患者的血漿代謝輪廓，并進(jìn)一步分析以氨基酸為目標(biāo)的代謝指紋，尋找代謝生物標(biāo)記群，希望找到一個(gè)有效的生物標(biāo)記物，能夠簡(jiǎn)單、快速的判定疾病發(fā)展的程度，在疾病發(fā)生早期即給予合理干預(yù)和靶向治療，延緩疾病的發(fā)生發(fā)展，監(jiān)測(cè)疾病的治療效果，降低子癇前期的發(fā)生率，改善母兒預(yù)后。
　　 第一章重度子癇前期患者的

6、血漿代謝組學(xué)分析
　　 [目的]
　　 本研究采用基于HPLC/MS/MS-QTrap的代謝組學(xué)方法對(duì)重度子癇前期婦女和正常妊娠婦女血漿代謝組分進(jìn)行檢測(cè)、分析，旨在了解重度子癇前期的代謝輪廓，結(jié)合模式識(shí)別化學(xué)信息學(xué)技術(shù)，對(duì)比差異代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物群，嘗試鑒定重度子癇前期的代謝生物標(biāo)記物，在疾病發(fā)生早期即給予合理干預(yù)和靶向治療，延緩疾病的發(fā)生發(fā)展，監(jiān)測(cè)疾病的治療效果，為進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制開辟新思路。
　　

7、[方法]
　　 1、標(biāo)本來(lái)源:選取2010年6月～11月在南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院產(chǎn)科住院分娩的重度予癇前期孕婦51例為重度子癇前期組。另選取同期定期產(chǎn)檢，排除妊娠期合并癥和并發(fā)癥，單胎懷孕至足月，產(chǎn)后追蹤胎兒無(wú)畸形的正常妊娠婦女45例（正常妊娠組）做為對(duì)照。研究對(duì)象入院后，立即抽取肘靜脈血3ml置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi)。輕顛倒抗凝管5次，使用冷凍離心機(jī)，4℃以1500轉(zhuǎn)離心15分鐘，取血漿置于-80℃冰箱保

8、存待測(cè)。
　　 2、樣品預(yù)處理:血漿室溫解凍后，吸取100μl置離心管中，加入300μl甲醇沉淀蛋白，渦旋混勻1分鐘，使用冷凍高速離心機(jī)，4℃離心15分鐘，12000轉(zhuǎn)。取上清液經(jīng)針頭式過(guò)濾器過(guò)濾后分析。
　　 3、高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)分析:分別設(shè)置液相色譜、質(zhì)譜條件及其工作模式，自動(dòng)加樣。
　　 4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法:原始的LC-MS數(shù)據(jù)文件，導(dǎo)入the MarkerViewTM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的提取及

9、前處理，采用主成分分析(PCA)觀察各組樣本間的總體分布狀況。然后用主成分判別分析法(PCA-DA)鑒別對(duì)各組間代謝輪廓差異貢獻(xiàn)較大的代謝物，找到與重度子癇前期最相關(guān)的差異代謝物。在MarkerViewTM軟件包中對(duì)相關(guān)的差異代謝物行t檢驗(yàn)。
　　 [結(jié)果]
　　 1、應(yīng)用HPLC/MS/MS-QTrap進(jìn)行檢測(cè)，得到重度子癇前期組和正常妊娠組血漿的代謝物總離子流色譜(total ion chromatogram，TIC

10、)對(duì)比圖。重度子癇前期組和正常妊娠組的血漿代謝物總離子流色譜圖有差別。
　　 2、應(yīng)用HPLC/MS/MS-QTrap進(jìn)行分離和檢測(cè)出九百多個(gè)代謝分子，得到代謝輪廓。51例重度子癇前期患者和45例正常妊娠婦女經(jīng)代謝組學(xué)方法得到很好的區(qū)分，并找到相對(duì)應(yīng)的16個(gè)潛在生物標(biāo)記物，其中濃度呈下降趨勢(shì)的代謝小分子有峰89、95、98、118、135、157、187、191、215、240，濃度呈上升趨勢(shì)的有峰139、155、284、451

11、、837、922。
　　 [結(jié)論]
　　 建立的基于HPLC/MS/MS-QTrap代謝組學(xué)方法可以區(qū)分重度子癇前期和正常妊娠，表明該方法適合于重度子癇前期的代謝組學(xué)研究。找到相對(duì)應(yīng)的16個(gè)潛在的生物標(biāo)記物，并對(duì)有差異的代謝物進(jìn)行增強(qiáng)型全掃描(EMS)及增強(qiáng)性子離子掃描(EPI)，提供了大量代謝物結(jié)構(gòu)上的信息，將來(lái)可以進(jìn)一步鑒定代謝物名稱并對(duì)其深入研究。綜合代謝標(biāo)記物變化趨勢(shì)構(gòu)成重度子癇前期的代謝特征，其對(duì)早期診斷重度子

12、癇前期有很好的前景。
　　 第二章重度子癇前期血漿氨基酸代謝輪廓分析
　　 [目的]
　　 本研究采用基于HPLC/MS/MS-QTrap的代謝組學(xué)方法分析重度子癇前期婦女和正常妊娠婦女氨基酸代謝指紋，建立基于HPLC/MS/MS-QTrap技術(shù)的血漿氨基酸代謝指紋方法。探討重度子癇前期氨基酸代謝輪廓，為進(jìn)一步研究氨基酸代謝在重度子癇前期發(fā)病代謝通路提供線索。
　　 [方法]
　　 1、標(biāo)本來(lái)源:

13、選取重度子癇前期婦女13例為重度子癇前期組，正常妊娠婦女10例做為對(duì)照。
　　 2、樣品預(yù)處理:待檢血漿室溫解凍后，吸取100μl置離心管中，加入300μl甲醇沉淀蛋白，渦旋混勻1分鐘，使用冷凍高速離心機(jī)，在4℃以12000轉(zhuǎn)離心15分鐘。取上清液經(jīng)針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，過(guò)濾后取50μl置于96孔過(guò)濾板中，每孔加入含氨基酸同位素內(nèi)標(biāo)的甲醇100μl，室溫放置20分鐘，萃取血片中的氨基酸，然后離心至另一個(gè)96孔聚丙烯板，50℃加熱吹干

14、，再加入60μl鹽酸正丁醇(3mol/L)，Teflon膜覆蓋，置65℃恒溫箱內(nèi)15分鐘，隨后50℃加熱吹干，再加入80％乙腈100μl溶解，鋁膜覆蓋，即可上樣檢測(cè)。
　　 3、高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)分析:分別設(shè)置液相色譜、質(zhì)譜條件及其工作模式，自動(dòng)加樣。
　　 4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法:定量分析采用軟件ChemoView1.2版本（美國(guó)生物應(yīng)用系統(tǒng)公司），根據(jù)同位素內(nèi)標(biāo)和各種丁酯化的氨基酸離子峰強(qiáng)度，由已知濃度的

15、內(nèi)標(biāo)，自動(dòng)計(jì)算出所測(cè)樣品中氨基酸的濃度。統(tǒng)計(jì)用SPSS13.0軟件，得到濃度結(jié)果數(shù)據(jù)以(x)士S表示，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，若方差齊則采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn);若方差不齊則采用近似t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1、本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HPLC/MS/MS-QTrap進(jìn)行檢測(cè)，成功得到重度子癇前期組和正常妊娠組血漿的氨基酸代謝指紋。
　　 2、HPLC/MS/MS-QTrap定量分析重度子癇前期組和正

16、常妊娠組血漿氨基酸代謝組，結(jié)果顯示兩組血漿氨基酸代謝組中苯丙氨酸、纈氨酸、精氨酸、鳥氨酸、脯氨酸差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.004、0.030、0.035、0.010、0.028）。
　　 [結(jié)論]
　　 建立的基于HPLC/MS/MS-QTrap代謝組學(xué)方法可以得到血漿氨基酸代謝輪廓譜，表明該方法適用于研究重度子癇前期的氨基酸代謝指紋。找到相對(duì)應(yīng)的5種氨基酸在重度子癇前期和正常妊娠婦女血漿代謝有差異，為生物標(biāo)記物群

17、預(yù)測(cè)重度子癇前期的發(fā)生提供線索。
　　 全文小結(jié)：
　　 1、建立的基于HPLC/MS/MS-QTrap代謝組學(xué)方法可以區(qū)分重度子癇前期和正常妊娠，表明該方法適合于重度子癇前期的代謝組學(xué)研究。
　　 2、找到相對(duì)應(yīng)的生物標(biāo)記物群，對(duì)其進(jìn)行增強(qiáng)型全掃描(EMS)及增強(qiáng)性子離子掃描(EPI)，提供了大量代謝物結(jié)構(gòu)上的信息，將來(lái)可以進(jìn)一步鑒定代謝物名稱并對(duì)其深入研究。
　　 3、代謝標(biāo)記物群在重度子癇前期血漿濃