應(yīng)用小干擾RNA研究Erβ在青春期椎體線性生長中的作用.pdf

1、目的:構(gòu)建成ERβ特異性打靶的基因沉默載體,并將其包裝為逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。分別轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞和小鼠,構(gòu)建ERβ基因沉默的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型。在細(xì)胞水平上,研究ERβ對(duì)成骨細(xì)胞的增殖能力的調(diào)控作用和細(xì)胞因子OPG和RANKL的分泌和表達(dá)的調(diào)控作用。在動(dòng)物水平的上,初步研究ERβ在青春期脊柱椎體線性生長中的作用,及其對(duì)部分主要細(xì)胞因子的調(diào)控作用。
　　方法:登陸genbank網(wǎng)站檢索小鼠ERβ cDNA序列的2個(gè)轉(zhuǎn)錄本。利用Ambion公

2、司的“SiRNA Target Finder”軟件設(shè)計(jì)針對(duì)ERβmRNA的siRNA序列,構(gòu)建成ERβ特異性打靶的基因沉默載體。檢測(cè)并篩選對(duì)ERβ沉默效果最佳者包裝成為病毒顆粒。以小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1為對(duì)象,設(shè)立3組,其中2個(gè)組分別轉(zhuǎn)染ERβ RNAi載體和陰性對(duì)照ERLRNAi載體,第3組為空白對(duì)照組。3組在相同條件下培養(yǎng)。然后,繪制各組細(xì)胞的生長曲線;分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期;檢測(cè)各組細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性;檢測(cè)各組細(xì)

3、胞形成鈣結(jié)節(jié);檢測(cè)各組細(xì)胞中OPG、RANKL表達(dá)的變化。取昆明小鼠36只,其中雌性和雄性各18只,分別隨機(jī)分為3組,分別為ERβ RNAi組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。制備ERβ沉默動(dòng)物模型。分別于動(dòng)物模型制作當(dāng)天、2周、4周和6周測(cè)量小鼠身長、體重。6周后,制作各組小鼠椎體組織切片分別進(jìn)行HE染色和Masson三色染色觀察椎體骺板軟骨細(xì)胞層的變化及骨小梁密度的差異;通過TUNEL檢測(cè)椎體內(nèi)細(xì)胞凋亡情況的差異;采用免疫組化的方法進(jìn)行檢測(cè)

4、細(xì)胞因子OPG和RANKL的表達(dá)差異。用SPSS16.0軟件分析各組差異的顯著性。
　　結(jié)果:所設(shè)計(jì)的2條RNAi打靶序列均在小鼠ERβ兩個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本中存在同源序列,但在小鼠其它基因組中未發(fā)現(xiàn)同源組序,可以同時(shí)打靶ERβ的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)質(zhì)粒測(cè)序證明重組質(zhì)粒DNA中含有shRNA序列。經(jīng)過轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)顯示,兩個(gè)Erβ沉默組PCR擴(kuò)增片段的電泳條帶明顯較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組減弱,且ERβRNAi-1條帶比ERβRNAi

5、-2條帶的灰度比小,均有顯著性差異,P＜0.05。對(duì)Erβ沉默效果較好的ERβRNAi-1質(zhì)粒進(jìn)行病毒包裝后,測(cè)得其病毒滴度T為106.67±025 IU/ml。繪制的生長曲線顯示ERβ RNAi組成骨細(xì)胞的增殖能力明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示ERβ RNAi組G1期細(xì)胞百分率明顯少于其它兩組,而S期和G2期細(xì)胞明顯百分率明顯高于其它兩組。RNAi組的ALP活性較其它兩組高;成骨結(jié)節(jié)較其它兩組的數(shù)量較多,體積較大。

6、Realtime-PCR檢測(cè)分析顯示,RNAi組OPG的Ct值較其它兩組小;RANKL的Ct值較其它兩組大。差異均有顯著性,P＜0.05。在雌性小鼠組中,ERβ RNAi組小鼠身長增加值高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組;體重增加值卻小于其它兩組,有顯著性差異,P＜0.05。制作椎體組織切片,經(jīng)檢測(cè)顯示,ERβ RNAi組小鼠椎體骺板下的骨小梁較其它兩組密集,而骺板下軟骨增殖層較薄,而且椎體生長板軟骨層結(jié)構(gòu)紊亂;椎體骺板下紐胞凋亡數(shù)量較其它兩組

7、多;椎體骺板下細(xì)胞因子OPG陽性數(shù)量較其它兩組多;細(xì)胞因子RANKL陽性數(shù)量則較其它兩組少。差異均有顯著性,P＜0.05。在雄性小鼠組中,上述備項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均無顯著性差異,P＞0.05。
　　結(jié)論:構(gòu)建的ERβ RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠有效沉默ERβ的表達(dá)。在細(xì)胞和動(dòng)物水平上,ERβ沉默后,成骨細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng),OPG表達(dá)增強(qiáng),RANKL表達(dá)減弱,ALP活性增加,骨形成量增加。因此,我們可以反向推斷,ERβ的表達(dá)可能直接和/或間