提高人體評(píng)分胚胎發(fā)育潛能及利用人多精受精卵進(jìn)行核移植的實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、研究背景和目的
　　 近年來的干細(xì)胞研究為組織修復(fù)提供了新的治療手段。要把干細(xì)胞有效、安全地應(yīng)用于臨床，必須進(jìn)行深入的機(jī)理研究和大量的在體與離體實(shí)驗(yàn)，需要大量的人源干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，hESC)是從人類早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出來的高度未分化的全能性細(xì)胞，在體外培養(yǎng)中可保持不分化狀態(tài)而無限增殖，并經(jīng)誘導(dǎo)可分化為不同類型的組織細(xì)胞，因此人胚胎干細(xì)胞建系后可作為理想的實(shí)驗(yàn)

2、材料而用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、藥學(xué)等方面的研究。
　　 hESC研究的最大制約因素，是胚胎來源有限。在人類的體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)的過程中，常常會(huì)觀察到產(chǎn)生無核碎片的胚胎。這種有碎片胚胎的發(fā)育潛能受限，移植后很少獲得妊娠，故患者通常會(huì)放棄這種胚胎。這些被放棄的胚胎可以用于人胚胎干細(xì)胞研究。
　　 低評(píng)分的人胚胎經(jīng)去碎片處理后，發(fā)育潛能可以

3、得到明顯提高。表觀遺傳學(xué)狀態(tài)與卵裂球的發(fā)育潛能有關(guān)。H3R26甲基化水平最高的卵裂球會(huì)形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，而甲基化水平低的卵裂球主要形成滋養(yǎng)外胚層。
　　 我們準(zhǔn)備利用碎片超過胚胎體積50％以上的四級(jí)人胚胎，采用酶消化的方法去除胚胎透明帶后，分散卵裂球，去除胚胎碎片，觀察胚胎發(fā)育潛能的變化，并在獲得囊胚后，嘗試進(jìn)行人胚胎干細(xì)胞建系工作。此外，選用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)為目的蛋白，觀察體外合成的EGFP-mRNA在小鼠胚胎中的表

4、達(dá)情況，為今后以mRNA顯微注射的方式人為干預(yù)卵裂球發(fā)育潛能打好實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 與動(dòng)物克隆的巨大成功相比，人類體細(xì)胞核移植(SCNT)研究的進(jìn)展相當(dāng)緩慢，其主要限制因素是人類卵子受到法律和倫理學(xué)的限制而難以獲得。除了卵子，受精卵的胞質(zhì)也可以支持體細(xì)胞的重編程。在人類IVF中常見的多精受精卵可以作為核移植受體而用于核移植研究，從而解決人類SCNT研究的瓶頸因素。已有研究者利用人多精受精卵進(jìn)行了SCNT研究，但克隆胚胎的發(fā)育沒有超

5、過8細(xì)胞期。
　　 克隆胚胎發(fā)育潛能受限，至少部分原因是重編程不完全。以DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(如5-氮雜胞苷)來部分擦除已有的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，有利于克隆胚胎的發(fā)育。
　　 我們利用人的多精受精卵為受體，人顆粒細(xì)胞為核供體，嘗試更為簡(jiǎn)捷有效的方法進(jìn)行人類體細(xì)胞核移植，并以5-氮雜胞苷對(duì)克隆胚胎進(jìn)行處理，觀察其發(fā)育潛能的變化，驗(yàn)證DNA甲基化水平的降低是否有利于克隆胚胎的發(fā)育。
　　 第一部分人胚胎去碎片培養(yǎng)

6、>　　 方法：
　　 (1)去碎片處理。以鏈酶蛋白酶消化人胚胎透明帶，在無鈣鎂培養(yǎng)液中分散卵裂球，以植物血凝素(PHA)處理卵裂球2小時(shí)，使卵裂球相互接近，然后對(duì)卵裂球進(jìn)行培養(yǎng)，直至形成囊胚。
　　 (2)人胚胎干細(xì)胞建系。分離囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)行原代克隆培養(yǎng)并連續(xù)傳代。
　　 結(jié)果：
　　 (1)對(duì)各組人胚胎進(jìn)行培養(yǎng)后，均可達(dá)到囊胚期。對(duì)照組與PHA處理組的囊胚發(fā)育率無差異(分別為30.0％、35％與3

7、6.4％)，而單純?nèi)ニ槠M的囊胚發(fā)育率明顯降低(11.5％)。
　　 (2)對(duì)原代克隆進(jìn)行培養(yǎng)后，繼續(xù)傳代未超過5代，未能獲得人胚胎干細(xì)胞系。
　　 結(jié)論：
　　 (1)對(duì)低評(píng)分人胚胎進(jìn)行去碎片操作后，能夠獲得高質(zhì)量囊胚。
　　 (2)PHA處理對(duì)于分散的卵裂球的發(fā)育有利。
　　 第二部分對(duì)小鼠胚胎進(jìn)行mRNA顯微注射的實(shí)驗(yàn)性研究
　　 方法：
　　 (1)構(gòu)建pcDNA3.0-E

8、GFP重組質(zhì)粒。
　　 (2)體外合成EGFP-mRNA。
　　 (3)收集小鼠2細(xì)胞期胚胎，顯微注射EGFP-mRNA，并觀察胚胎發(fā)育情況及熒光表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)與對(duì)照組相比，接受mRNA(無論是否加polyA尾)顯微注射的小鼠胚胎發(fā)育到囊胚的比率略有下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(囊胚發(fā)育率：對(duì)照組64.41％；未加polyA尾注射組48.98％；加polyA尾注射組55.74％)。

9、　　 (2)注射未加polyA尾的EGFP-mRNA后，小鼠胚胎沒有表達(dá)綠色熒光；注射加polyA尾的EGFP-mRNA后，小鼠胚胎表達(dá)綠色熒光的比率增加到36.07％，R組與RA組之間表達(dá)熒光的比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而囊胚發(fā)育率的差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 (1)mRNA顯微注射本身并不影響胚胎的發(fā)育潛能。
　　 (2)mRNA在細(xì)胞內(nèi)順利表達(dá)的關(guān)鍵是體外合成時(shí)是否成功添加合適長(zhǎng)度的polyA尾

10、。
　　 第三部分利用人多精受精卵進(jìn)行核移植
　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)如下：PSZ-C：對(duì)照組1，不進(jìn)行任何操作而直接培養(yǎng)，以驗(yàn)證培養(yǎng)體系的有效性；PSZ-H：以Hoechst33342進(jìn)行染色后，用紫外線進(jìn)行短暫觀察，以排除核染色與紫外線照射對(duì)胚胎發(fā)育的影響；EO：在間期去除3個(gè)原核中的一個(gè)，以驗(yàn)證顯微操作對(duì)胚胎發(fā)育的影響；NT：顆粒細(xì)胞核移植組，未經(jīng)5-氮雜胞苷處理；NT-Aza：顆粒細(xì)胞核移植組，經(jīng)

11、0.01mM5-氮雜胞苷處理。
　　 (1)核移植。在有絲分裂間期去除人多精受精卵的細(xì)胞核，以顯微注射方式把人顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核注射到去核的受精卵中，按照分組接受或不接受5-氮雜胞苷的處理，進(jìn)行胚胎培養(yǎng)。
　　 (2)收集分裂期的人類多精受精卵(PSZ-C)、經(jīng)過5-氮雜胞苷處理的分裂期的核移植胚胎(NT-AZA-C)以及未經(jīng)5-氮雜胞苷處理的分裂期的核移植胚胎(NT-C)，進(jìn)行5-甲基胞嘧啶免疫熒光染色，以共聚焦顯微鏡觀

12、察熒光并拍照，以ImageJ軟件分析熒光強(qiáng)度。
　　 結(jié)果：
　　 (1)顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。72.6±6.0％的顆粒細(xì)胞為G0/G1期。
　　 (2)PSZ-C組單純培養(yǎng)后獲得4個(gè)囊胚，囊胚發(fā)育率為11.1％。PSZ-H組獲得1個(gè)囊胚，囊胚發(fā)育率為7.7％。EO組獲得4個(gè)囊胚，囊胚發(fā)育率為12.9％。各組的8細(xì)胞期胚胎發(fā)育率與囊胚發(fā)育率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (3)核移植的胚胎發(fā)育沒有超過8細(xì)

13、胞期。在NT-CB組中對(duì)29枚胚胎進(jìn)行了操作，存活率為48.3％，卵裂率為21.4％，沒有發(fā)育到8細(xì)胞期的胚胎；在NT組中對(duì)61枚胚胎進(jìn)行了操作，存活率為73.8％，卵裂率為48.9％，發(fā)育達(dá)到8細(xì)胞期的比率為11.1％；在NT-Aza組中對(duì)64枚胚胎進(jìn)行了操作，存活率為81.3％，卵裂率為65.4％，發(fā)育達(dá)到8細(xì)胞期的比率為32.7％。NT-CB組的胚胎存活率、卵裂率和8細(xì)胞期發(fā)育率均低于其余兩組。NT和NT-Aza組在8細(xì)胞期的胚胎

14、發(fā)育率方面的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (4)NT-AZA-C和NT-C組之間熒光強(qiáng)度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NT-AZA-C組的熒光強(qiáng)度明顯降低，但仍未降至PSZ-C組的水平。
　　 (5)核移植胚胎出現(xiàn)異常的核分裂模式。
　　 結(jié)論：
　　 (1)顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期狀態(tài)適于核移植。
　　 (2)本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)體系條件適宜。
　　 (3)Hoechst33342染色及短時(shí)間的紫外線照射不影響胚

15、胎發(fā)育。
　　 (4)5-氮雜胞苷處理有利于核移植胚胎的發(fā)育。
　　 (5)表觀遺傳學(xué)狀態(tài)的異常與核分裂模式的異常是核移植胚胎發(fā)育潛能受限的重要原因。
　　 小結(jié)
　　 1、對(duì)低評(píng)分人胚胎進(jìn)行去碎片操作后，能夠獲得高質(zhì)量囊胚。PHA處理對(duì)于分散的卵裂球的發(fā)育有利。
　　 2、mRNA顯微注射本身并不影響胚胎的發(fā)育潛能。mRNA在細(xì)胞內(nèi)順利表達(dá)的關(guān)鍵是體外合成時(shí)是否成功添加合適長(zhǎng)度的polyA尾。<