不同肢體訓(xùn)練促進(jìn)腦梗死大鼠腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)通過患側(cè)、雙側(cè)功能訓(xùn)練治療后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試來了解不同功能訓(xùn)練的效果；通過患側(cè)、雙側(cè)功能訓(xùn)練研究梗死灶同側(cè)和對(duì)側(cè)不同區(qū)域內(nèi)源性NSCs的增殖和分化的情況，對(duì)內(nèi)源性NSC的激活時(shí)機(jī)、激活部位以及定向控制進(jìn)行初步的探討；研究抑制梗死灶周圍炎性反應(yīng)及減輕膠質(zhì)細(xì)胞形成的瘢痕對(duì)雙側(cè)功能訓(xùn)練的結(jié)果產(chǎn)生的影響。
　　 方法：
　　 采用Wistar大鼠(成年雄性，270-300g)進(jìn)行大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO

2、)模型。部分大鼠在術(shù)中頸內(nèi)靜脈注射辣椒素或生理鹽水。MCAO術(shù)后24小時(shí)，參考Longa等和Bederson的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，不符合要求或手術(shù)后未能生存至預(yù)定時(shí)間的大鼠被淘汰。隨機(jī)選取符合上述標(biāo)準(zhǔn)的64只大鼠(其中注射辣椒素和生理鹽水的大鼠共16只)假手術(shù)組16只，未注射辣椒素和生理鹽水的大鼠隨機(jī)分成2組(3天組和14天組)，每組又分為4個(gè)亞組(患側(cè)功能訓(xùn)練組、雙側(cè)功能訓(xùn)練組、無治療組和假手術(shù)組)，假手術(shù)組2只，其他亞組各8只。

3、注射辣椒素和生理鹽水的16只大鼠隨機(jī)分成2組，3天組和14天組，每組分成假手術(shù)組、雙側(cè)功能訓(xùn)練組和雙側(cè)功能訓(xùn)練組+辣椒素組。各組大鼠在網(wǎng)狀制動(dòng)籠中飼養(yǎng)，其頭端有一容器可放置食物和水源，大鼠的四肢及軀體能被籠中裝置牢固制動(dòng)。患側(cè)功能訓(xùn)練組和雙側(cè)功能訓(xùn)練組在MCAO術(shù)后24小時(shí)開始行肢體的功能訓(xùn)練。訓(xùn)練內(nèi)容為：每天置于自制滾筒式網(wǎng)狀訓(xùn)練器內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)訓(xùn)練，平衡木上行走訓(xùn)練，轉(zhuǎn)棒上轉(zhuǎn)動(dòng)訓(xùn)練及網(wǎng)屏抓握訓(xùn)練共40min，1次/d，手術(shù)24h后開始治

4、療，至動(dòng)物處死。在患側(cè)功能訓(xùn)練組中，用膠布將健側(cè)上肢纏起來，限制健側(cè)肢體的使用，強(qiáng)迫大鼠使用患側(cè)上肢。在雙側(cè)功能訓(xùn)練組中，不限制健側(cè)肢體的使用，訓(xùn)練內(nèi)容同患側(cè)功能訓(xùn)練組。無治療組無功能訓(xùn)練。各組別在MCAO術(shù)后3天和術(shù)后14天行肢體運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能評(píng)估后，分別隨機(jī)選取4只大鼠，用多聚甲醛心腔灌注處死，快速斷頭取腦，連續(xù)冠狀石蠟切片，HE染色計(jì)算腦梗死灶體積，免疫組織化學(xué)方法分析Nestin、GFAP和MAP2的染色形態(tài)、分布和強(qiáng)度；免疫熒光

5、雙標(biāo)分析Nestin/膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidicprotein，GFAP)和Nestin/微管相關(guān)蛋白2(microtubule associatedprotein2，MAP2)的染色形態(tài)、分布。另4只生理鹽水心腔灌注，快速斷頭取腦，組織勻漿，Western bloaing定量檢測(cè)腦梗死灶周圍皮質(zhì)和對(duì)側(cè)半球相應(yīng)腦組織的Nestin、GFAP、MAP2、的蛋白表達(dá)量。各檢測(cè)指標(biāo)均同時(shí)與sham組大鼠比

6、較。注射辣椒素和生理鹽水的16只大鼠隨機(jī)分成2組，3天組和14天組，每組分成假手術(shù)組、雙側(cè)功能訓(xùn)練組和雙側(cè)功能訓(xùn)練組+辣椒素組，功能訓(xùn)練項(xiàng)目同上，分別在MCAO術(shù)后3天和14天，斷頭取腦，行免疫組化染色，觀察P物質(zhì)在腦內(nèi)的分布。分別在所有圖像均使用NIH Image J1.31處理軟件分析，全部數(shù)據(jù)均采用SPSS for Windows13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，行單因素方差分析(ANOVA)，比較各組間及各時(shí)間點(diǎn)間的差異，P<0.05

7、時(shí)，有顯著性意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、第一部分
　　 (1)神經(jīng)功能綜合評(píng)分
　　 術(shù)后3天，與無治療組相比，患側(cè)和雙側(cè)功能訓(xùn)練組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。與單側(cè)功能訓(xùn)練組比較，雙側(cè)功能訓(xùn)練組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。術(shù)后14天，與無治療組相比，患側(cè)和雙側(cè)功能訓(xùn)練組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。與單側(cè)功能訓(xùn)練組比較

8、，雙側(cè)功能訓(xùn)練組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 (2)組織學(xué)的結(jié)果
　　 ①梗死體積
　　 3天組和14天組中，患側(cè)功能訓(xùn)練組、雙側(cè)功能訓(xùn)練組和無治療組的梗死體積大小占健側(cè)大腦半球的比值無顯著差異。
　　 第二部分
　　 1、免疫組織化學(xué)
　　 (1)梗死周圍皮質(zhì)
　　 梗死灶周圍Nestin染色：術(shù)后3天，無治療組、患側(cè)功能訓(xùn)練組和雙側(cè)功能訓(xùn)練組梗

9、死灶皮質(zhì)周圍Nestin染色顯著增強(qiáng)(P<0.05)。Nestin染色細(xì)胞數(shù)目增多，尤以患側(cè)和雙側(cè)功能訓(xùn)練組更為明顯(P<0.05)。患側(cè)功能訓(xùn)練組和雙側(cè)功能訓(xùn)練組梗死灶皮質(zhì)周圍Nestin染色無顯著差異(P>0.05)。梗死灶周圍皮層GFAP和MAP2染色：術(shù)后3天，各組GFAP、MAP2染色增強(qiáng)，尤以患側(cè)和雙側(cè)功能訓(xùn)練組明顯，可持續(xù)至MCAO術(shù)后14天(P<0.05)?；紓?cè)和雙側(cè)功能訓(xùn)練組之間無顯著差異(P>0.05)。
　　

10、 (2)對(duì)側(cè)半球相應(yīng)腦組織
　　 對(duì)側(cè)半球相應(yīng)腦組織Nestin染色：術(shù)后3天，與無治療組相比，患側(cè)和雙側(cè)功能訓(xùn)練組對(duì)側(cè)半球相應(yīng)腦組織Nestin染色顯著增強(qiáng)(P<0.05)。Nestin染色細(xì)胞數(shù)目增多，尤以患側(cè)和雙側(cè)功能訓(xùn)練組更為明顯。與患側(cè)功能訓(xùn)練組相比較，雙側(cè)功能訓(xùn)練組Nestin染色增強(qiáng)(P<0.05)。與術(shù)后3天相比，術(shù)后14天雙側(cè)功能訓(xùn)練組的Nestin染色持續(xù)增強(qiáng)(P<0.05)。術(shù)后3天，各組CFAP染色增強(qiáng)

11、，尤以雙側(cè)功能訓(xùn)練組更為明顯(P<0.05)，可持續(xù)至MCAO術(shù)后14天。術(shù)后14天，各組MAP2染色增強(qiáng)，尤以雙側(cè)功能訓(xùn)練組更為明顯(P<0.05)，可持續(xù)至MCAO術(shù)后14天。
　　 2、免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)Nestin/GFAP和Nestin/MAP2
　　 梗死灶周圍皮層Nestin/GFAP和Nestin/MAP2染色：術(shù)后3天，各組Nestin/GFAP、Nestin/MAP2染色增強(qiáng)，尤以患側(cè)和雙側(cè)功能訓(xùn)練組明

12、顯，可持續(xù)至MCAO術(shù)后14天(P<0.05)?；紓?cè)和雙側(cè)功能訓(xùn)練組之間無顯著差異(P>0.05)。
　　 對(duì)側(cè)半球相應(yīng)腦組織：Nestin/GFAP和Nestin/MAP2染色：術(shù)后3天，各組Nestin/GFAP染色增強(qiáng)，尤以雙側(cè)功能訓(xùn)練組更為明顯(P<0.05)，可持續(xù)至MCAO術(shù)后14天。術(shù)后14天，各組Nestin/MAP2染色增強(qiáng)，尤以雙側(cè)功能訓(xùn)練組更為明顯(P<0.05)，可持續(xù)至MCAO術(shù)后14天。
　　

13、 2、Western Blot檢測(cè)不同部位腦組織Nestin、GFAP和MAP2的表達(dá)。
　　 (1)梗死周圍皮質(zhì)
　　 術(shù)后3天，與無治療組相比，患側(cè)功能訓(xùn)練組和雙側(cè)功能訓(xùn)練組梗死灶皮質(zhì)周圍Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達(dá)量顯著增強(qiáng)(P<0.05)?；紓?cè)功能訓(xùn)練組和雙側(cè)功能訓(xùn)練組梗死灶皮質(zhì)周圍Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達(dá)量無顯著差異(P<0.05)；術(shù)后14天，與無治療組相比較，患側(cè)和雙側(cè)功能訓(xùn)

14、練組Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達(dá)量增強(qiáng)(P<0.05)；與患側(cè)功能訓(xùn)練組相比，雙側(cè)功能訓(xùn)練組的Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達(dá)量無顯著差異(P<0.05)。與術(shù)后3天相比，術(shù)后14天患側(cè)和雙側(cè)功能訓(xùn)練組的梗死灶皮質(zhì)周圍Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達(dá)量無顯著差異(P<0.05)。
　　 (2)對(duì)側(cè)半球相應(yīng)腦組織
　　 術(shù)后3天，與無治療組相比，患側(cè)和雙側(cè)功能訓(xùn)練組對(duì)側(cè)半球相應(yīng)腦組織Nes

15、tin、GFAP和MAP2蛋白的表達(dá)量顯著增強(qiáng)，尤以雙側(cè)功能訓(xùn)練組更為明顯(P<0.05)。與患側(cè)功能訓(xùn)練組相比較，雙側(cè)功能訓(xùn)練組Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達(dá)量增強(qiáng)(P<0.05)。與術(shù)后3天相比，術(shù)后14天雙側(cè)功能訓(xùn)練組的對(duì)側(cè)半球相應(yīng)腦組織Nestin、GFAP和MAP2蛋白的表達(dá)量持續(xù)存在。
　　 第三部分
　　 1、神經(jīng)功能綜合評(píng)分
　　 術(shù)后3天，S組、BT組和BT+C組神經(jīng)功能缺損評(píng)分無顯

16、著差異(P<0.05)。術(shù)后14天，與BT組相比，BT+C組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 2、腦梗死體積
　　 假手術(shù)組腦組織呈均勻紅色，未見白色梗死區(qū)；BT組和BT+C組腦組織均可見整個(gè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)呈白色梗死灶，右側(cè)腦組織未見白色梗死區(qū)，呈均勻紅色。除假手術(shù)組外，在術(shù)后3天，其他兩組體積比較無顯著差異(P<0.05)。在術(shù)后14天，與BT組相比，BT+C組的梗死體積比明顯減少(P

17、<0.05)。
　　 3、SP免疫組化陽性強(qiáng)度結(jié)果
　　 (1)梗死周圍皮質(zhì)
　　 梗死灶周圍SP染色：術(shù)后3天，假手術(shù)組有少量SP染色陽性細(xì)胞；BT組和BT+C組梗死灶皮質(zhì)周圍SP染色細(xì)胞增多，與BT組相比，BT+C組SP染色細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)。術(shù)后14天，SP染色細(xì)胞持續(xù)存在。與BT組相比，BT+C組SP染色細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.05)。與3天時(shí)相比，這種趨勢(shì)明顯增高(P<0.05)。如圖9

18、所示。
　　 (2)對(duì)側(cè)半球相應(yīng)腦組織
　　 對(duì)側(cè)半球相應(yīng)腦組織SP染色：術(shù)后3天，BT和BT+C組對(duì)側(cè)半球相應(yīng)腦組織SP染色增強(qiáng)(P<0.05)。SP染色細(xì)胞數(shù)目增多，BT組和BT+C組SP染色細(xì)胞數(shù)目無顯著差異(P<0.05)。與術(shù)后3天相比，術(shù)后14天BT組和BT+C組的SP染色明顯減少(P<0.05)。BT組和BT+C組SP染色細(xì)胞數(shù)目無顯著差異(P<0.05)。如圖10所示。
　　 結(jié)論：
　　

19、 1、腦梗塞恢復(fù)早期，與患側(cè)肢體的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練相比，雙側(cè)肢體的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)顯著；患側(cè)和雙側(cè)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使梗死灶的體積無明顯變化。
　　 2、患側(cè)和雙側(cè)功能訓(xùn)練加強(qiáng)梗死灶周圍皮質(zhì)的內(nèi)源性干細(xì)胞的增殖和分化，兩者之間相比無顯著性差異；與患側(cè)功能訓(xùn)練組相比較，雙側(cè)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以加強(qiáng)對(duì)側(cè)半球相應(yīng)腦組織的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及分化。
　　 3、本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為臨床腦梗塞病人的康復(fù)提供了方便而實(shí)用的治療方法：即患肢和健肢同時(shí)的運(yùn)動(dòng)