EMMPRIN在涎腺腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲中的作用及機制研究.pdf

1、涎腺腺樣囊性癌（salivaryadenoidcysticcarcinoma,SACC）是唾液腺最常見的惡性腫瘤之一，具有嗜神經(jīng)侵襲（perineuralinvasion,PNI）的特性。由于SACC極易沿神經(jīng)浸潤性生長和轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除范圍不易掌握，常導(dǎo)致患者預(yù)后較差。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer,EMMPRIN）在多種惡性腫瘤中高表達，通過

2、調(diào)節(jié)多種基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）的表達從而促進惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，EMMPRIN在SACC嗜神經(jīng)侵襲中的作用及機制尚不明確，仍需進一步研究。
　　研究目的：
　　1.利用免疫組化、免疫熒光，westernblot方法分析EMMPRIN在SACC組織和細(xì)胞系中的表達及與SACC嗜神經(jīng)侵襲的關(guān)系。
　　2.利用蛋白拮抗和RNAi技術(shù)分析EMMPRIN在SACC細(xì)胞

3、嗜神經(jīng)侵襲中的作用及可能機制。
　　研究方法：
　　1.采用免疫組化EnvisionTM法檢測35例嗜神經(jīng)侵襲和37例無神經(jīng)侵襲SACC組織中EMMPRIN、MMP-2、MMP-9的表達情況，分析EMMPRIN的表達與嗜神經(jīng)侵襲、MMP-2及MMP-9表達之間的關(guān)系；采用細(xì)胞免疫組化、免疫熒光，westernblot方法檢測EMMPRRIN在SACC-LM和SACC-83細(xì)胞系的表達情況；通過抗體拮抗實驗分析拮抗EMMPRI

4、N的表達對SACC-LM細(xì)胞體外粘附、明膠酶分泌和侵襲能力的影響。
　　2.通過RNAi技術(shù)和EMMPRINsiRNA慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定沉默EMMPRIN表達的SACC-83細(xì)胞株。
　　3.利用黏附實驗、明膠酶譜實驗分析沉默EMMPRIN對SACC-83細(xì)胞黏附和MMPs分泌能力的影響；利用MTT、荷瘤實驗、體外嗜神經(jīng)侵襲模型、體內(nèi)嗜裸鼠坐骨神經(jīng)侵襲模型分析沉默EMMPRIN對SACC-83細(xì)胞增殖和嗜神經(jīng)侵襲的影響。

5、
　　主要實驗結(jié)果：
　　1.EMMPRIN在SACC組織和細(xì)胞系高表達，EMMPRIN、MMP-2和MMP-9在SACC嗜神經(jīng)侵襲組的表達明顯高于無神經(jīng)侵襲組，EMMPRIN與SACC的嗜神經(jīng)侵襲現(xiàn)象及MMP-2、MMP-9的表達顯著相關(guān)，拮抗EMMPRIN在SACC-LM細(xì)胞系的表達可顯著抑制SACC-LM細(xì)胞黏附ECM的能力、MMP-2和MMP-9的表達及體外侵襲能力。
　　2.成功構(gòu)建了EMMPRINsiRNA

6、慢病毒真核表達載體系統(tǒng)。結(jié)合有限稀釋法及G418壓力篩選，構(gòu)建了EMMPRINsiRNA慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，證實在篩選獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，EMMPRIN在mRNA和蛋白水平均可被顯著抑制。
　　3.沉默EMMPRIN基因可顯著抑制SACC-83細(xì)胞體外增殖、對ECM和神經(jīng)細(xì)胞的黏附、MMP-2和MMP-9的分泌及體外嗜神經(jīng)侵襲性能力。裸鼠荷瘤實驗顯示沉默EMMPRIN基因可顯著抑制SACC-83細(xì)胞的體內(nèi)成瘤體積及細(xì)胞增殖

7、指數(shù)。體內(nèi)嗜裸鼠坐骨神經(jīng)侵襲模型顯示沉默EMMPRIN基因可顯著抑制SACC-83細(xì)胞的體內(nèi)嗜神經(jīng)侵襲，減輕坐骨神經(jīng)功能障礙和腫脹程度，同時抑制腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達。
　　結(jié)論：
　　1.EMMPRIN在SACC組織和細(xì)胞系高表達，與SACC的嗜神經(jīng)侵襲現(xiàn)象顯著相關(guān)。
　　2.EMMPRIN在SACC嗜神經(jīng)侵襲過程中發(fā)揮重要作用，其促SACC嗜神經(jīng)侵襲的機制是：（1）誘導(dǎo)SACC細(xì)胞對ECM和神經(jīng)