南方根結(jié)線蟲效應(yīng)蛋白Misp12功能分析和淡紫紫孢菌寄生適應(yīng)性的比較基因組研究.pdf

1、根結(jié)線蟲是一類重要的植物寄生線蟲，能寄生植物根部形成根結(jié)，造成作物減產(chǎn)。線蟲致病機(jī)理和生防菌殺蟲機(jī)制是植物線蟲學(xué)研究的兩個(gè)重要領(lǐng)域。對根結(jié)線蟲致病相關(guān)機(jī)理，如寄生相關(guān)基因特別是分泌效應(yīng)蛋白等的研究，可以更好的了解根結(jié)線蟲寄生過程中相關(guān)基因的調(diào)控，篩選出新的靶標(biāo)基因?yàn)殚_發(fā)新型防治線蟲藥劑提供參考依據(jù)。同時(shí)，對線蟲生防菌的寄生機(jī)理研究，有助于通過遺傳改造提高生防菌的效果。
　　本論文通過生物信息學(xué)方法挖掘了南方根結(jié)線蟲(Meloido

2、gyne incognita)效應(yīng)蛋白Misp12并對其功能進(jìn)行了驗(yàn)證;通過基因組和轉(zhuǎn)錄組測序解析了線蟲卵寄生真菌淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)卵寄生過程中的相關(guān)基因表達(dá)和對多種環(huán)境適應(yīng)性的組學(xué)基礎(chǔ)。
　　根結(jié)線蟲在寄生取食植物根部時(shí)，分泌蛋白起著關(guān)鍵性的作用?，F(xiàn)階段的線蟲效應(yīng)蛋白研究集中在早期寄生過程中，少有對后期寄生過程中的效應(yīng)蛋白的研究。本文通過生物信息學(xué)預(yù)測得到南方根結(jié)線蟲效應(yīng)子Misp1

3、2，然后進(jìn)行克隆測序和表達(dá)動(dòng)態(tài)分析，采用細(xì)胞定位和VIGS等試驗(yàn)對其進(jìn)行了功能驗(yàn)證，研究發(fā)現(xiàn)Misp12基因基因長度為1202 bp，編碼149個(gè)氨基酸長度的蛋白質(zhì)，該基因在南方根結(jié)線蟲中高度保守，基因少有突變;編碼的蛋白由線蟲的背腹食道腺特異表達(dá)，且在線蟲成熟期即雌蟲時(shí)期有相當(dāng)高的表達(dá)量;亞細(xì)胞定位表明ΔspMisp12-GFP融合蛋白定位在植物細(xì)胞質(zhì)中;VIGS沉默Misp12基因后根結(jié)數(shù)量、線蟲數(shù)量和產(chǎn)卵量都有減少，尤其是雌蟲數(shù)目

4、減少最多;沉默后對相關(guān)信號途徑的防御基因進(jìn)行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)相對于對照組，沉默Misp12基因煙草植株防御基因都上調(diào)表達(dá)，而在煙草葉片上瞬時(shí)表達(dá)該基因能夠抑制由INF1引起的細(xì)胞程序性死亡，該過程中植物細(xì)胞的SA信號途徑基因會被抑制表達(dá)，說明該基因可能抑制了植物防御基因的表達(dá)。
　　作為一種能夠寄生線蟲卵的真菌，淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)有很高的生防價(jià)值?，F(xiàn)在已有淡紫紫孢菌的生防制劑注冊面

5、市，但是該菌寄生線蟲卵的機(jī)制仍不明確。本文通過對Illumina測序的淡紫紫孢菌的基因組和寄生線蟲卵早期的轉(zhuǎn)錄組的比較分析發(fā)現(xiàn)淡紫紫孢菌與昆蟲病原真菌親緣關(guān)系近，尤其與冬蟲夏草的親緣關(guān)系最近，在74～94百萬年前出現(xiàn)物種分離;與來自印度的測序菌株全基因組比對分析表明36-1的基因組具有更多的序列重排及SNP;淡紫紫孢菌重復(fù)序列誘導(dǎo)點(diǎn)突變(RIP)機(jī)制較弱，在進(jìn)化過程中經(jīng)受的選擇壓力較低;相對于其他真菌，淡紫紫孢菌富含絲氨酸蛋白酶、幾丁質(zhì)

6、降解酶類、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因;對附著胞形成相關(guān)基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)有357個(gè)基因被鑒定為附著胞相關(guān)基因，并且在侵染過程中起作用，其中有27個(gè)基因具有4倍以上的表達(dá)量;轉(zhuǎn)錄組分析表明淡紫紫孢菌寄生線蟲的模式可能與綠僵菌屬真菌侵染昆蟲相一致，在侵染過程中可能會受到線蟲胚胎的氧化防御反應(yīng); GO富集分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因主要集中在氧化還原活性，核糖體結(jié)構(gòu)成分，轉(zhuǎn)移酶活性以及膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性上，KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)基因主要集中在能量、氨基