南方根結(jié)線蟲MiMPK1基因分離及其RNAi抗線蟲效果研究.pdf

1、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)是真核細(xì)胞中一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，對(duì)維持細(xì)胞正常生理功能起著極其重要的作用，深入研究植物寄生線蟲MAPK的功能對(duì)線蟲防治具有重要意義。 本研究克隆了南方根結(jié)線蟲(MeloidogyneincognitaChitwood)MAPK基因MiMPK1，利用RNAi技術(shù)對(duì)線蟲的卵塊和2齡幼蟲進(jìn)行了離體干擾效應(yīng)驗(yàn)證，并通過表達(dá)MiMPK1，基因片

2、段dsRNA的轉(zhuǎn)基因番茄植株對(duì)線蟲進(jìn)行了RNAi活體效應(yīng)驗(yàn)證，為探討MiMPK1基因的功能及其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 主要研究結(jié)果如下： 1.利用生物信息學(xué)篩選靶標(biāo)基因的EST序列，采用RACE法從南方根結(jié)線蟲體內(nèi)克隆了目的基因cDNA全長序列，并進(jìn)行深入分析?；蛉L1358bp，包含1185bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)含394個(gè)氨基酸的蛋白，預(yù)測蛋白分子量大約是45.4KDa，等電點(diǎn)6.5，GenBank登錄號(hào)為DQ9235

3、92。生物信息分析表明，靶標(biāo)基因即為MAPK基因MiMPK1。進(jìn)一步研究確定了MiMPK1基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，為多拷貝基因。對(duì)MiMPK1基因進(jìn)行原核表達(dá)，表達(dá)分子量與預(yù)測值相符。MiMPK1編碼蛋白具有MAPK的11個(gè)保守結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點(diǎn)TEY模體，無跨膜結(jié)構(gòu)，預(yù)測其三維結(jié)構(gòu)具有高度保守性。進(jìn)化分析表明，MiMPK1編碼蛋白與人類和植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與小鼠和果蠅親緣關(guān)系較近。 2.體外合成MiMPK1基因片段

4、的dsRNA，利用浸泡法同時(shí)處理南方根結(jié)線蟲的卵塊和2齡幼蟲，對(duì)其進(jìn)行離體干擾效應(yīng)驗(yàn)證。卵塊浸泡在2mg/mldsRNA1天后，觀察到孵化出的2齡幼蟲數(shù)量明顯多于對(duì)照組，但其死亡率卻達(dá)到85％以上，而對(duì)照組的死亡率不高于5％；將孵化出的線蟲和未孵化的卵塊一同接種到番茄根部，45天后發(fā)現(xiàn)番茄根部沒有根結(jié)和卵塊，說明MiMPK1基因被沉默的幼蟲無侵染力。卵塊浸泡在2mg/mldsRNA3天后，孵化出的2齡幼蟲死亡率幾乎達(dá)到100％極顯著高于

5、對(duì)照組，但孵化出的2齡幼蟲數(shù)量極顯著低于對(duì)照組。2齡幼蟲浸泡在2mg/mldsRNA6h后，線蟲的活力明顯下降；將處理的2齡幼蟲接種到番茄根部，45天后發(fā)現(xiàn)番茄根部的根結(jié)和卵塊數(shù)量與對(duì)照相比明顯下降。RT-PCR分析表明靶標(biāo)mRNA表達(dá)量明顯降低。上述研究結(jié)果表明MiMPK1，基因在線蟲的發(fā)育與寄生中具有關(guān)鍵作用。 3.通過植物介導(dǎo)沉默靶標(biāo)基因?qū)€蟲進(jìn)行RNAi活體效應(yīng)研究。研究通過構(gòu)建目的基因的dsRNA干擾表達(dá)載體，將MiM

6、PK1基因和Mi-sf基因的片段分別正向和反向插入到載體中，得到表達(dá)目的基因dsRNA干擾載體pCAGC1341-TGPM02RNAi和pCAGC1341-TGAW01RNAi。根據(jù)已建立的高效快速農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化程序，通過農(nóng)桿菌EHA105將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化番茄，獲得了dsRNA干擾表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因番茄。PCR擴(kuò)增檢測顯示大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株都能擴(kuò)增出目的基因片段。對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行Southern分析，證明外源基因已成功整合到植物基因

7、組中，RT-PCR驗(yàn)證外源基因高效表達(dá)。將2齡幼蟲接種到T0代植株，14天后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄的根結(jié)數(shù)量極顯著低于對(duì)照組，表達(dá)MiMPK1基因dsRNA的番茄與表達(dá)Mi-sf基因dsRNA的番茄相比，根結(jié)數(shù)明顯減少，表明轉(zhuǎn)基因番茄具有高效的抗蟲作用，且轉(zhuǎn)MiMPK1基因番茄的抗蟲效果優(yōu)于轉(zhuǎn)Mi-sf基因的番茄。 充分說明MiMPK1基因在線蟲的發(fā)育與寄生中具有關(guān)鍵作用，表明MiMPK1的dsRNA干擾在植物抗線蟲的基因工程中具有應(yīng)用